Ветеринарно-санитарный контроль остаточных количеств антибиотиков в продукции животноводства

Охрана продукции животноводства от чужеродных химических веществ — важная ветеринарно-санитарная проблема

Современное отношение к вопросам безопасности питания возникло относительно недавно, хотя история этой проблемы началась давно. Говоря о безопасности, возникает много путаницы, и, прежде всего это происходит из-за невозможности всегда правильно оценить риск компонентов пищевых продуктов. Необходимо решать вопрос — является ли химическое вещество в сырье или продукте микробным токсином, витамином, гормональным препаратом, продуктом метаболизма микроорганизмов, естественным или искусственным загрязнителем из внешней среды, пищевой добавкой, красителем? Попало оно в пищевой продукт извне или присутствовало в нем изначально, накопилось или проявило свои свойства во время технологической обработки или хранения и т. д.?

Все перечисленные вещества используются во всем мире, в том числе и у нас, для коррекции (исправления) различных негативных факторов, присутствующих при выращивании животных и их переработке. Использование биологически активных веществ — необратимый процесс. Он продиктован необходимостью добиваться увеличения приростов массы тела животных, повышения питательности и усвояемости кормов, коррекции иммунного статуса поголовья. Антибиотики, витамины, ферменты, микроэлементы, стимуляторы роста в той или иной степени сглаживают отрицательное действие техногенных факторов на продуктивность животных. Без них было бы невозможно создать и поддерживать современную технологию содержания животных, добиться безупречности кормов по питательному составу, переваримости, повысить продуктивность животных и снизить их заболеваемость.

Согласно предложенной классификации, все вещества, влияющие на продуктивность животных, подразделяются на три основные группы:

- чужеродные, потенциально опасные соединения антропогенного или природного происхождения ксенобиотики (антибиотики, гормональные препараты, тяжелые металлы, пестициды).

- средства, не являющиеся жизненно необходимыми для жизни животных, — эрготропики;

- средства, являющиеся жизненно необходимыми и обладающие питательной ценностью, — кормовые добавки.

Ксенобиотики это вещества антропогенного или природного характера, преднамеренно вводимые в организм животного и человека или попадающие туда в силу объективных обстоятельств, а также образующиеся в организме в результате метаболических процессов.

По результатам мониторинга, проводимого Институтом питания РАМН, за последние пять лет определены основные пути загрязнения животноводческой продукции:

- использование неразрешенных препаратов или применение разрешенных антибиотиков, кормовых добавок, профилактических и лечебных медикаментов в завышенных дозах;

- загрязнение продуктов животноводства пестицидами, используемыми для борьбы с вредителями растений и в ветеринарной практике для профилактики заболеваний животных;

- применение новых нетрадиционных технологий производства кормов, полученных путем микробиологического синтеза;

- нарушение гигиенических правил использования твердых и жидких отходов животноводства, сточных вод, осадков очистных сооружений;

- миграция в продукты животноводства токсических веществ из оборудования, посуды, инвентаря вследствие использования неразрешенных антибиотических консервантов;

- образование в пищевых продуктах эндогенных токсических соединений из чужеродных веществ в процессе теплового воздействия или других способов технологической обработки;

- несоблюдение регламентированных требований в технологии производства и хранения продуктов животноводства;

- поступление в животноводческую продукцию токсических веществ из окружающей среды воздуха, почвы, водоемов.

Наибольшую опасность с точки зрения распространенности и токсичности имеют следующие контаминанты: антибиотики — остаточные их количества обнаруживаются в 15 — 26 % продукции животноводства и птицеводства; тяжелые металлы и металлоиды, поступающие из естественных источников и при выбросах промышленных отходов; метаболиты микроорганизмов и микроскопических грибов, накапливающиеся в кормах; пестициды; нитраты, нитриты, нитрозамины, встречающиеся практически во всех мясных, молочных и рыбных продуктах, из-за нерационального применения азотистых удобрений; гормональные препараты, используемые несанкционированно или нерационально для повышения продуктивности животных.

Общие сведения об антибиотиках

Антибиотики (от греч. anti против, bios жизнь) биологически активные вещества, являющиеся продуктами жизнедеятельности различных организмов (грибов, бактерий, животных, растений) и обладающие способностью в чрезвычайно малых концентрациях избирательно подавлять (убивать) микро- и паразитоорганизмы in vitro (в питательной среде) и in vito (в организме больного).

Из химиотерапевтических средств антибиотики не имеют себе равных по широте и глобальности применения в медицине и ветеринарии при многих инфекционных и инвазионных болезнях. Кроме того, ряд препаратов повышает защитные силы организма, действует антитоксически и ростостимулирующе.

Антибиоз, или антагонизм, одна из широко распространенных в микромире форм взаимодействия микроорганизмов, которая проявляется способностью вырабатывать биологически активные вещества, угнетающие рост и развитие других видов. Наиболее эффективными из них являются специфические продукты обмена, получившие название «антибиотики».

Понятие «антибиотик» впервые высказал в прошлом веке Вильемен, но термин «антибиотик» в современном понимании ввел Ваксман, который писал: «Антибиотики являются продуктом обмена веществ живой клетки, который в очень малых концентрациях оказывает угнетающее действие на рост и уничтожает микроорганизмы». Продуценты антибиотиков грибы, микроорганизмы и многие другие представители растительного и животного мира.

История целенаправленного поиска и использования антибиотических средств уходит в глубокую древность. По дошедшим до нас сведениям, еще 3 500 лет назад в Китае пользовались заплесневелым творогом, а позднее и хлебом для лечения различных гнойных ран. В IX в. н. э. в Азербайджанской медицинской академии использовали различные растительные порошки с добавлением плесеней из хлеба, молочных продуктов и меда.

Вплотную к открытию антибиотиков подошел наш соотечественник Полотебнов А. Г., сообщивший в 1872 г. о лечении гнойных ран порошком из плесени спор гриба пенициллиум. Однако эра антибиотиков и антибиотикотерапии связана с именем Флеминга, который в 1929 г. сообщил об антимикробном действии вещества, полученного им из плесени пенициллиум. Тем не менее потребовалось еще десятилетие, прежде чем пенициллин был внедрен в практику. С этим успешно справились Флори и Чейн, получившие впервые в 1940 г. химически чистый пенициллин.

Использование антибиотиков в мировой практике явилось революцией в биологической науке. Ваксман писал: «Влияние антибиотиков на человеческую общность настолько сильно, что наше время можно назвать эрой антибиотиков». He случайно третий период развития фармакологии начинается именно с 1929 г. и называется периодом химиотерапии, главенствующее место в нем занимают антибиотики.

По химической структуре антибиотики можно разделить на 6 групп: 1) антибиотики гетероциклической структуры (циклы, которые кроме атомов углерода включают и другие атомы, чаще всего кислорода, азота и серы). Эти соединения широко распространены в природе (витамины, ферменты, антибиотики, алкалоиды и др.). Представители группы — пенициллины и цефалоспорины;

2) антибиотики алициклического строения (соединения с циклическимрасположением атомов углерода). Представители группы — тетрациклины,имеющие в молекуле 4 конденсационных ядра бензола;

3) гликозиды и аминогликозиды (соединения, содержащие сахара, агликоны иаминогруппы). Включают 5 групп: гликозиды, аминогликозиды, макролиды,полиены и анзамицины;

4) антибиотики ароматического ряда (производные нитробензола).

Представитель — левомицетин;

5) антибиотики — полипептиды (соединения, содержащие аминокислоты).

Представители — полимиксин, грамицидин и др.;

6) представители разных групп. В эту группу входят многие противоопухолевые антибиотики. Например, производные ауреловой кислоты и др.

По происхождению антибиотики подразделяются на 4 группы:

производные грибов (основной арсенал антибиотиков): лучистые грибы — пенициллины, цефалоспорины; актиномицеты — аминогликозиды; стрептомицеты — тетрациклины, макролиды, стрептомицин, полиены;

антибиотики бактериального происхождения — полипептиды;

антибиотики из растений: бессмертник — аренарин, зверобой — иманин, хинное дерево — хинин, шалфей — сальвин и др.;

антибиотики из животных тканей: молока рыб — экмолин, лейкоциты (костный мозг, селезенка) — интерферон (лейкоцитарный, фиброцитарный, иммунный), яичный белок — лизоцим.

Большинство антибиотиков (пенициллины, тетрациклины, макролиды и др.) обладают антимикробным действием. Ряд препаратов действует на пато-генные грибы. Это противомикозные антибиотики — полиены (нистатин, леворин, амфотерицин Б и др.). Есть антибиотики, обладающие противоопухолевой активностью, рубомицин, оливомицин и др. И наконец, антибиотики, обладающие противопаразитарным действием, ивомек, сококс и др.

При действии на микробные клетки антибиотики либо задерживают их рост бактериостатическое действие (тетрациклины, макролиды и др.), либо убивают их бактерицидное действие (пенициллин, стрептомицин, аминогликозиды).

В отличие от протоплазматических ядов и других химических элементов, губительно действующих на микробную клетку, антибиотики характеризуются избирательностью и специфичностью. Специфичность действия проявляется в том, что они влияют на различные виды обмена веществ, которые играют особенно важную роль у микроорганизмов, но при этом не нарушают или практически не затрагивают основные процессы жизнедеятельности макроорганизма.

По механизму биохимического действия антибиотики можно подразделить на 6 групп:

1) ингибирующие клеточную стенку микроорганизмов — пенициллины, цефалоспорины;

2) ингибирующие синтез белка — тетрациклины, аминогликозиды и макролиды;

подавляющие синтез РНК- рифампицин, оливомицин;

подавляющие синтез ДНК — рубомицин;

мембраноактивные антибиотики — нистатин, полимиксин;

ингибирующие процессы дыхания — натулин.

Антибиотики подразделяются на препараты с узким и широким спектром антимикробного действия. Антибиотики с узким спектром антимикробного действия проявляют активность по отношению (чаще всего) к грамположительным микроорганизмам (пенициллин, олеандомицин, макролиды и др.). Антибиотики с широким спектром действия ингибируют грамотрицательную (в большей степени) и грамположительную микрофлору (ампициллин, неомицин, тетрациклин и др.).

Однако и эти уникальные лекарственные средства обладают негативными эффектами, проявляя в определенных случаях побочное действие на организм (аллергия — наиболее сильными аллергенами являются пенициллин и тилозин, дисбактериозы, нефротоксический эффект, гепатоксический эффект и другие явления), что следует учитывать при антибиотикотерапии.

Антибиотики могут значительно потерять свою эффективность при выработке устойчивости у патогенной микрофлоры.

Многие авторы считают, что степень развития устойчивости у микроорганизмов зависит от свойства препарата и вида возбудителя. Различают два вида развития устойчивости: 1) стрептомициновый (быстрый) — олеандомицин, новобиоцин и др.; 2) пенициллиновый, при котором наблюдается медленное, ступенеобразное развитие устойчивости. К этой группе принадлежит большинство используемых в практике антибиотиков: пенициллин, левомицетин, полимексин, полиеновые антибиотики и др.

Постепенно нарастает (вырабатывается) резистентность к тетрациклинам, канамицину, неомицину, мономицину, цефалоспорину.

По степени увеличения лекарственной устойчивости (способности противостоять разрушению) антибиотики можно расположить в следующем порядке: бацитрацин, флавомицин, виргиниомицин и родственные соединения; тилозин, другие макролиды, фураны, полимиксины; пенициллин, тетрациклины; ампициллин, цефалоспорины. Далее следуют сульфаниламиды, стрептомицин и другие аминогликозиды. Затем хлорамфеникол.

Одна из причин, ускоряющих выработку устойчивости у патогенной микрофлоры к антибиотикам, является нерациональное их применение (занижение дозы, уменьшение курса, применение без учета чувствительности и др.)

Антибиотики применяют с лечебно-профилактическими целями, поэтому

необходимо знать время циркуляции препаратов в организме, чтобы при убое

животных они не обнаруживались в органах и тканях.

Согласно методическим указаниям по применению антибиотиков в

ветеринарии (1973) перед убоем животных, в том числе птиц, применение

антибиотиков должно быть прекращено в сроки: при использовании

непролонгированных пенициллинов, эритромицина, алеандомицина — за 1 сут тетрациклинов, левомицетина — за 3 суток, стрептомицина, канамицина, неомицина, мономицина — за 7 суток; при введении пролонгированных антибиотиков: бициллинов — за 6 суток, дибиомицина — за 30 суток, дитетрациклина — за 25 суток. Мясо животных, в том числе птиц, вынужденно убитых в момент применения антибиотиков или в сроки до выведения препаратов из организма, используют в порядке, указанном в «Правилах ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1983 г.).

Лечебные антибиотики.

Пенициллины.

По химической структуре антибиотики этих групп относятся к гетероциклическим соединениям (в циклах кроме углерода имеются азот и сера) и по строению весьма сходны, так как содержат р-лактамное кольцо. В то же время структуры пенициллина включают тиазолқдиновое, а цефалоспорина — дигидротиазиновое кольцо. Поэтому структурная основа пенициллина пред-ставлена 6-аминопенициллановой кислотой, а цефалоспорина — 7-аминоцефалоспорановой кислотой.

Сходство в химическом строении предопределяет и некоторые фармакологические свойства пенициллинов и цефалоспоринов. Как те, так и другие действуют на микробную клетку (угнетают образование клеточной стенки бактерий) и грамположительную микрофлору.

Пенициллины первые антибиотики, не утратившие значение и сегодня. Продуцентами являются грибы рода Penicillium. Существует 2 способа получения пенициллинов: биосинтетический, путем ферментации, и синтетический — из ядра пенициллина — б-аминопенициллиновой кислоты. Исходя из этого, пенициллины делятся на 2 группы:

1) природные (биосинтетические) пенициллины — бензилпеницилин и его соли, феноксиметилпенициллин;

2)полусинтетические пенициллины — пенициллиназоустойчивые

(метициллин, оксациллин, клоксициллин, диклоксациллин) и широкого спектра антимикробного действия, действующие на грамположительную и грамотрицательную микрофлору (ампициллин, карбициллин).

Биосинтетические пенициллины (бензилпенициллин и др.) получают на жидких питательных средах в специальных емкостях ферментаторах, в которых выращиваются определенные штаммы гриба.

Бензилпениллин одноосновная кислота, полученая путем замещения в аминогруппе 6-аминопенициллановой кислоты одного водорода на бензильный радикал.

Активность пенициллинов определяют методом диффузии в агар. При этом на чашки Петри с агаром вносят (в лунки) препарат в разных концентрациях и определяют после термостатирования зоны задержки роста тест-культуры, предварительно посеянной на агар; сравнивают со стандартом. Одна единица действия (1 ЕД) соответствует активности 0,6 мкг чистого крис-таллического бензилпенициллина (в виде натриевой соли).

В основе антимикробного действия пенициллина лежит подавление биосинтеза клеточной стенки микроорганизма, основу которой составляет сложный пептидогликан. Пенициллины подавляют активность ферментов, участвующих в синтезе пептидогликана, что прекращает рост микроорганизмов. Одновременно активизируются ферменты, гидролизующие пептидогликан, нарушаются ковалентные связи клеточной стенки. Растущие клетки перестают делиться, набухают и распадаются. Поскольку основной «мишенью» пенициллинов служит пептидогликан, отсутствующий в макроорганизме, эти препараты обладают весьма низкой токсичностью.

Пенициллины в лечебном эффекте удачно сочетают антимикробное действие и благоприятное воздействие на организм. Это проявляется в активации защитных механизмов последнего: повышении фагоцитоза, снижении уровня интоксикации организма, активации окислительно-восстановительных процессов.

Антибиотики применяют с лечебно-профилактической целью при многих заболеваниях животных, в том числе зверей, птиц, рыб и пчел. При парентеральном введении препараты быстро всасываются, достигая максимальной концентрации через 30-60 мин, быстро распространяются по всему организму (кроме головного и спинного мозга) и уже через 4-6 ч в крови обнаруживают лишь следы препарата. До 90 % пенициллинов выводится из организма почками, остальное количество различными железами.

Пенициллины применяют при бактериальных инфекциях животных, вызываемых грамположительной микрофлорой, с целыо предупреждения осложнений, а также при патологиях с антимикробными ассоциациями (сибирская язва, пастереллез, септицемия, стафилококкозы, рожа свиней, мыт лошадей, инфекционный стоматит, ринит, спирохетоз птиц, пневмонии, маститы, метриты и др.).

Побочное действие пенициллинов в основном проявляется аллергическими реакциями: крапивница, дерматиты, фарингиты, вплоть до анафилактического шока, которые встречаются в 0,01 % случаев.

Бензилпенициллина натриевая и калиевая соли. Белые кристаллические (иногда аморфные) порошки, хорошо растворимые в воде, этаноле, эфире. Растворы быстро теряют активность, разрушаются при кипячении, а также под действием кислот, щелочей. 1 ЕД = 0,6 мкг химически чистого бензилпенициллина. Применяют внутримышечно или подкожно с интервалами 4 — 6 ч (стерильные изотонические растворы хлорида натрия, дистиллированной воды, 0,51 % новокаина) в виде присыпок на раневые поверхности и аэрозольно.

Бензилпенициллина новокаиновая соль. Моногидрат новокаиновой кислоты. Фармакологическое действие, показания к применению, дозы и условия хранения те же, что и для натриевой и калиевой солей бензилпенициллина. В отличие от них препарат при растворении в воде образует суспензию, медленно всасывается и обладает пролонгированным действием, терапевтическая концентрация в крови сохраняется до 12 ч. Поэтому назначается 1-2 раза в сутки.

Бициллины-1, -3 и -5- пролонгированные антибиотики.

Бициллин-1 N,N-дрібензилэтилендиаминовая соль бензилпенициллина. Бициллин-3 — смесь бициллина-1, натриевой (или калиевой) и новокаиновой солей бензилпенициллина. Бициллин-5 — смесь бициллина-1 и бензилпенициллина новокаиновой соли в соотношении 4:1. Белые порошки, образующие с водой суслензию. По спектру антимикробного действия подобны бензилпенициллину. В организме создают депо пенициллина. Применяют внутримышечно в дозах на 1 кг массы: крупным животным 10 000-15 000 ЕД, овцам и свиньям 15 000-20 000, мелким животным 20 000-30 000 ЕД; бициллин-1 — 1 раз в 7 дней, бициллин-3 — 1 раз в 3-4 дня и бициллин-5 — 1 раз в 14-21 день.

Феноксиметилпенициллин. Феноксиметилпенициллиновая кислота. По фармацевтическому действию аналогичен бензилпенициллину; отличается тем, что не разрушается в желудке (кислотоустойчив) и хорошо всасывается.

Метициллина натриееая солъ. Полусинтетический пенициллин с фармакологическими свойствами, присущими бензилпенициллину. Отличие: эффективен в отношении стафилококков, устойчивых к пенициллину (вырабатывающих пенициллиназу, инактивирующую антибиотик).

Оксациллина натриевая солъ. Полусинтетический пенициллин. Фармакологические свойства (действие) сходны с натриевой солью пенициллина. Отличие: кислотоустойчива, поэтому можно применять орально и внутримышечно.

Ампициллин.

Карбенпенициллина динатриееая соль. Полусинтетический пенициллин широкого действия. Порошок, легко растворим в воде.Применяют в основном парентерально, как натриевую соль ампициллина, в тех же случаях и дозах.

Микроцид. Пенициллиновый антибиотик для наружного применения. Жидкость. Действует на грамположительную и грамотрицательную микрофлору. Применяют при инфицированных ранах, язвах, ожогах и др.

Цефалоспорины.

К цефалоспоринам относятся природные антибиотики и их полусинтетические производные, имеющие в своей основе 7-аминоцефалоспорановую кислоту. Обладают широким спектром антибактериальной активности. Ha микробную клетку действуют бактерицидно. По механизму действия, как и пенициллины, относятся к ингибиторам синтеза клеточной стенки бактерий. Устойчивость у микроорганизмов к цефалоспоринам развивается медленно.

В настоящее время получено более 10 полусинтетических цефалоспоринов, которые оказались активнее природных антибиотиков.

Применяют при острых и хронических инфекциях органов дыхания, мочевых путей, половых органов, инфекциях мягких тканей. Антибиотик проникает (медленно) в спинномозговую жидкость. Чаще используют при сепсисе и острых респираторных, желудочно-кишечных инфекциях. При высоких дозах возможен нефротоксический эффект.

Цефалоридин. Белый кристаллический порошок, хорошо растворим в воде, водные растворы темнеют на свету.

Цефалотин. Белый кристаллический порошок, хорошо растворим в воде. По фармакологическому действию близок к цефалоридину.

Цефалексин. Белый порошок, трудно растворим в воде. Устойчив в кислой среде. Быстро (в течение 1,52 ч) всасывается при приеме внутрь. Фармакологическое действие сходно с другими цефалоспоринами.

Тетрациклины

Тетрациклины, или циклоалканы (антибиотики алициклической структуры), имеют циклическое расположение атомов углерода (см. выше химическую структуру). Основу химического строения тетрациклинов составляют четыре конденсированных ядра бензола, получившие название «тетрациклины» и давшие это название всей группе веществ. Эта группа включаёт ряд антибиотиков и их полусинтетические производные, родственные по химическому строению, антимикробному спектру и механизму действия.

Тетрациклины различаются между собой некоторыми особенностями антимикробного действия, скоростью всасывания в организме и выведения из него, метаболизмом и токсичностью.

Антибиотики этой группы активны в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, устойчивы в кислой среде и в ней более активны. Антибиотические спектры индивидуальных тетрациклинов очень близки между собой. Их активность в отношении грамположительных бактерий несколько выше, чем в отношении грамотрицательных, и уменьшается в ряду хлортетрациклин — тетрациклин — окситетрациклин. Многие штаммы грамотрицательных бактерий немного чувствительнее к тетрациклину, чем к другим представителям.

Устойчивость у микроорганизмов к тетрациклинам развивается медленно. Действуют эти антибиотики бактериостатически. В основе их действия лежит нарушение синтеза белка на уровне рибосом. В более высоких концентрациях они тормозят синтез мукопептида клеточной стенки бактерий и действуют уже бактерицидно.

Тетрациклины хорошо всасываются при всех методах введения (пероральном, внутримышечном, ингаляционном), создают в крови высокие концентрации и проникают почти во все органы и ткани, за исключением головного и спинного мозга. Однако при патологических состояниях оболочек головного или спинного мозга тетрациклины проникают и в эти органы. Про-никновению через гематоэнцефалический барьер способствуют некоторые инфекционные заболевания и интоксикация организма. Через плацентарный барьер тетрациклины проникают сравнительно легко.

После перорального применения максимальная концентрация антибиотиков в крови достигается через 1,5-4 ч и терапевтические концентрации удерживаются до 8-12 ч, а привнутримышечных инъекциях — до 12-24 ч. При ингаляциях наивысшие концентрации препаратов регистрируются в легких и сохраняются в этом органе до 36-48 ч. При всех случаях введения тетрациклины длительно (до 6-7 сут) обнаруживаются в костном мозге, а у молодняка и в костной ткани. Поэтому сроки убоя животных на мясо должны определяться не ранее чем через 7 дней после применения препаратов.

Тетрациклины наиболее широко применяют в ветеринарной практике почти при всех бактериальных, вирусных (для профилактики бактериальных осложнений) инфекциях всех видов домашних животных, зверей и птицы, a также всеми способами введения перорально, внутримышечно, аэрозольно и др. Оспование для этого назначения тетрациклинов, впрочем, как и других антибиотиков, чувствительность патогенной микрофлоры.

Следует помнить, что общностью механизма действия и антимикробного эффекта препараты тетрациклиновой группы вызывают перекрестную устойчивость: микроорганизмы, устойчивые к одному препарату, устойчивы и к другим антибиотикам этой группы.

Из побочных явлений тетрациклины могут вызвать дисбактериоз, гепатотоксический эффект (при длительном применении в высоких дозах), a также отрицательно влиять на скелет растущего эмбриона.

Тетрациклин. Желтый кристаллический порошок без запаха, горького вкуса, мало растворим в воде, трудно в спирте. Устойчив в кислой среде.

Тетрациклина гидрохлорид. Отличается от тетрациклина лучшей растворимостью в воде, поэтому может применяться внутримышечно и ипгаляционно.

Окситетрациклина гидрохлорид и хлортетрациклина гидрохлорид. По антибактериальному спектру близки к тетрациклину.

Морфоциклин. Синтетическое производное тетрациклина: один атом в карбоксамидной группе (CONH2) тетрациклина замещен группой метилморфолина. Пористая масса темно-желтого цвета, горького вкуса. Легко

растворим в воде. Разрушается под действием концентрированных растворов кислот и щелочей.Антибактериальный спектр сходен с другими тетрациклинами, поэтому применяют при аналогичных случаях и особенно когда надо очень быстро создать высокие концентрации препарата в организме (например, при сепсисе). Назначают интравенозно (нельзя подкожно возможно образование инфильтратов) или ингаляционно в тех же дозах, как и тетрациклин. Кроме активности в отношении микроорганизмов, на которые действуют и другие тетрациклины, морфоциклин действует на микоплазмы.

Метациклина гидрохлорид. Полусинтетический тетрациклин, близок к окситетрациклину. Отличается от других тетрациклинов тем, что лучше всасывается при приеме внутрь и дольше сохраняется в крови.

Диоксициклина гидрохлорид. Полусинтетическое производное окситетрациклина, отличается от других тетрациклинов более длительным нахождением в организме до 24 ч (в кровяном русле).

Тетрахлорид. Лекарственная форма тетрациклина гидрохлорида. Выпускается специально для ветеринарии. Порошок, хорошо растворяется в воде, 1 ЕД = 1 мкг. Фармакологические свойства препарата — аналогичны тетрациклину, поэтому применяют в тех же случаях.

Антибиотики-гликозиды

Антибиотики-гликозиды большая группа антибиотических препаратов различного антимикробного действия с весьма обширными подгруппами, включающими несколько антибиотиков. Например, подгруппа аминогликозидов (неомицин, гентамицин и др.), антибиотики-макролиды.

Гликозиды широко распространены в растительном мире. Они представляют собой вещества, в которых гликозильная часть молекулы (циклическая форма сахаров)связана через атомы кислорода, серы или азота с радикалОіМ органического соединения, не являющегося сахаром. Последний носит название агликона, или генина. Среди гликозидов много биологически активных веществ, используемых в медицине и ветеринарии в качестве лечебных средств, витамины, ферменты, антибиотики, алкалоиды и др.

Стрептомицины.

Первым был стрептомицин, открытый Ваксманом в 1944 г. Стрептомицин органическое основание, типичный гликозид, состоит из трех частей: стрептидина (агликона), стрептозы и метилглюкозамина, составляющих сахарную часть молекулы. Стрептомицин и его производные обладают широким спектром антимикробного действия. Эффективны в отношении большинства грамотрицательных и некоторых грамположительных микроорганизмов, включая пенициллиноустойчивые формы. Основное же применение стрептомицинов в медицине при туберкулезе, так как эти антибиотики проявляют антимикробное действие в отношении кислотоустойчивых бактерий, какой является туберкулезная палочка.

Хотя стрептомицины весьма эффективны при колибактериозе, сальмонеллезе, целом ряде маститов и пневмоний, следует помнить, что все они противотуберкулезные препараты I ряда. Поэтому их применение в ветеринарии должно быть крайне ограниченным, а в идеальном варианте лучше вообще не применять их.

Антибиотики-аминогликозиды.

Представители этой группы (неомицин, мономицин, гентамицин, канамицин и др.) по структуре сходны со стрептомицинами. В состав их молекул входят аминогруппы. Агликоны этих антибиотиков подобно стрептомицину представляют собой производное инозита, в котором две оксигруппы замещены аминогруппами, а в качестве сахаров содержатся аминосахара (аминоглюкоза, аминопираноза).

Большинство антибиотиков этой группы получают с помощыо продуцентов грибов рода Actinomyces fradia и др. Имеются и полусинтетические производные.

Все аминогликозиды антибиотики широкого спектра действия, оказывающие бактерицидный эффект на грамположительные и грамотрицательные (особенно) микроорганизмы. Наиболее эффективны эти препараты в отношении возбудителей колибактериоза, сальмонеллезов, пастереллеза. Некоторые антибиотики этой группы (гентамицин) активны в отношении микоплазм, поэтому показаны при респираторном микоплазмозе. В желудочно-кишечном тракте всасываются плохо, поэтому в основном реко-мендуются для внутримышечных инъекций, ингаляционного применения и наружно. Разные препараты в той или иной мере различаются по активности, спектру и длительности действия, токсичности. Механизм действия связан с подавлением синтеза белка микробной клетки на уровне рибосом, а также с воздействием на некоторые ферментные системы. Активность от 680 до 1000 ЕД в 1 мг.

Основное побочное действие нефротоксичность и ототоксичность. Кроме того, при длительном применении некоторых аминогликозидов (например, неомицина) возможны случаи грибковой суперинфекции увеличение (в качественном и количественном плане) грибной флоры (Candida,Aspergillius и др.).

Неомицина сульфат. Сам по себе неомицин (основание) комплексный антибиотик (неомицин А, В и С), образующийся при ферментации гриба-продуцента. Неомицина сульфат смесь сульфатов неомицинов. Белый или желтовато-белый порошок почти без запаха. Легко растворим в воде, очень мало в спирте. Гигроскопичен. При внутримышечном введении быстро поступает в кровь, сохраняя терапевтические концентрации в течение 812 ч.Хранят по списку Б 3 года (мази 2 года).

Неомизолъ. Пленкообразующий препарат в аэрозольной упаковке. В его состав входят неомицина сульфат, этилцеллюлоза, касторовое масло, спирт. Применяют для первичной обработки небольших повреждений кожи (порезы, ссадины, трещины), при необширных ожогах. При нанесении на кожу образуется тонкая пленка, остающаяся в течение 68 ч. При необходимости пленка может быть удалена спиртом, эфиром, хлороформом. Загрязненные раны предварительно обрабатывают перекисью водорода. He рекомендуется ис-пользовать при обширных повреждениях, кровоточащих ранах и воспалительных явлениях.

Мономицин. Смесь сульфатов органического основания, про-дуцированного лучистым грибом. По антимикробному действию и химической структуре близок к неомицину, в отличие от последнего обладает способностью подавлять развитие ряда простейших: возбудителя кожного лейшманиоза, токсоплазмы, дизентерийной амебы и др.

Канамицин. Антибиотик широкого спектра действия, как и неомицин. Кроме того, действует на кислотоустойчивые бактерии, включая микобактерии туберкулеза. Эффективен в отношении тех же микроорганизмов, что и другие препараты группы неомицина (перекрестная устойчивость). Выпускают в виде солей: канамицина моносульфат и капамицина сульфат, представляющих собой порошки, легко растворимые в воде. Первый препарат применяют орально при кишечных инфекциях (кишечная палочка, шигеллы, сальмонелла и др.), второй внутримышечно при инфекциях, вызванных микрофлорой, чувствительной к данному препарату. Учитывая, что канамицин является противотуберкулезным препаратом II порядка, его применение в ветеринарии, как и стрептомицина, следует ограничивать.

Гентамицина сулъфат. Белый порошок с кремоватым оттенком, легко растворим в воде и нерастворим в спирте. Как и другие антибиотики-аминогликозиды, обладает широким спектром антимикробного действия. После инъекций терапевтические концентрации создаются в крови через 1 ч и сохра-няются на протяжении 812 ч. Применяют при многих инфекционных заболеваниях, вызванных чувствительными к нему микроорганизмами (при бронхопневмониях, перитонитах, септицемии, раневой инфекции, респираторных инфекциях, сальмонеллезах и др.). Обычно назначают при различных смешанных инфекциях, а также в случаях, когда возбудитель еще не установлен. Часто его применяют в сочетании с полусинтетическими пенициллинами ампициллином и карбенициллином, с которыми он дает синергидный эффект. Кроме указанных возбудителей гентамицин активен в отношении микоплазм, поэтому в форме аэрозолей получил широкое распространение для лечебно-профилактических обработок в птицеводстве или при глубинном методе обеззараживания инкубационных яиц в сочетании с тилозином или фармазином. В последнее время в ветеринарии испытывают и другие аминогликозиды: тобрамицин, сизомицина сульфат, амикацин и др. Все эти препараты по спектру антимикробного действия близки к гентамицину, но значительно активнее в отношении некоторых патогенных возбудителей. Антибиотики очень эффективны при различных смешанных инфекциях. Вводят внутримышечно,

Спектомицин. По химическому составу близок к аминогликозидам. Продуцируется различными стрептомицетами. Белый порошок, легко растворимый в воде. В Россию поступает в виде коммерческого препарата спектам В, содержащего 50 % антибиотика. Проявляет бактериостатический эффект в отношении многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (кокков, клостридий, эшерихий, сальмонелл и др.), а также в отношении микоплазм, на которые действует бактерицидно. Применяют при бактериальных инфекциях молодняка животных, в том числе птиц: колибактериозе, сальмонеллезе, респираторном микоплазмозе, пастереллезе, диспепсиях молодняка различной этиологии, инфекционном синусите птиц и др.

Кристаллический порошок белого цвета без запаха, горького вкуса. Мало растворим в воде, легко в спирте. 1 ЕД = 1 мкг. Применяют перорально в виде мази при гнойных поражениях кожи, инфицированных ранах, ожогах.

Эритромицина фосфат. Фосфорная соль эритромицина для виутривенных инъекций. Показания к применению пневмонии.

Олеандомицина фосфат. Кристаллический порошок или пористая масса белого или белого с желтоватым оттенком цвета, горького вкуса. Легко растворим в воде, в разбавленных растворах кислот и спиртах. По спектру антибактериального действия сходен с эритромицином: действует в основном на грамположительную микрофлору. Применяют при гастроэнтеритах пневмониях, метритах, эндометритах, вызванных чувствительными к олеандомицину микроорганизмами, в тех же случаях, что и эритромицин.

Подгруппа тилозина.

В эту подгруппу макролидов входят продуцируемые грибом Streptomyces fradie антибиотики, содержащие активное вещество тилозин. Представители подгруппы: тилозин (США), спирамицин (Франция), фармазин (ряд зарубежных стран, в том числе Болгария) и фрадизин (Россия).

Антибиотики-анизамицины.

Из этой группы практическое значение имеют два антибиотика: природный рифамицин и полусинтетический рифампицин.

Рифамицин. Порошок, плохо растворим в воде. Активен в отношении

грамположительной микрофлоры, туберкулезной палочки, в больших дозах

против грамотрицательных бактерий.В медицине используют в качестве

противотуберкулезногосредства.

Рифампицин. Производное рифамицина, поэтому фармакологическое действие весьма сходное. В отличие от рифампицина эффективен при применении внутрь (первый не всасывается из желудочно-кишечного тракта) и обладает более широким спектром антимикробного действия.Как и рифамицин, используется в основном в качестве противотуберкулезного средства. Исходя из этого, весьма нежелательно применятъ данные антибиотики в ветеринарии.

Антибиотики ароматического ряда.

Из большого числа антибиотиков, являющихся ароматическими соединениями, в практике применяют хлорамфеникол, или левомицетин, обнаруженный впервые в 1947 г. в культуральной жидкости из актиномицета. В 1949 г. установлена его химическая структура и осуществлен синтез. Левомицетин был первым антибиотиком, химический синтез которого внедрен в промышленном масштабе. Этому в значительной степени способствовала химическая структура левомицетина. Он относится к числу производных нитробензола. Левомицетин и его препараты высокоэффективны при многих бактериальных инфекциях животных. Однако им свойственны выраженные побочные действия: раздражение слизистой оболочки кишечника, дисбактериоз, токсическое влияние на гемопоэз, вплоть до возникновения геморрагического синдрома.

Левомицетин. Синтетическое вещество, идентичное природному антибиотику хлорамфениколу. Белый или белый со слабым желтовато-зеленоватым оттенком кристаллический порошок горького вкуса. Мало растворим в воде, легко в спирте. 1 ЕД = 1 мкг. Механизм действия связан с нарушением синтеза белка микроорганизмов. Является антибиотиком широкого спектра действия, эффективен в отношении многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, риккетсий, спирохет и некоторых крупных вирусов. Действует на штаммы, устойчивые к пенициллину, стрептомицину, сульфаниламидам. Действие бактериостатическое. Устойчивость микроорганизмов к левомицетину развивается медленно. Легко всасывается из желудочно-кишечного тракта, распространяясь почти по всем органам и тканям, проникает через гематоэнцефалический барьер. Терапевтические концентрации в крови удерживаются до 57 ч. Из организма выводится быстро, главным образом через почки.

Применяют при многих бактериальных инфекциях животных и птиц: диспепсиях, сальмонеллезе, колибактериозе, колиэнтеритах, лептоспирозе, пастереллезе, бронхопневмониях, инфекциях мочевых путей. Входит в состав многих аэрозольных баллонов: левовинизоля, лергазоля, олазоля и др., а также мазей.

Левомицетина стеарат. Соль левомицетина и стеариновой кислоты, содержащей 55 % антибиотика. Белый с желтоватым оттенком порошок, не имеет горького вкуса. В желудочно-кишечном тракте омыляется с образованием левомицетина, который всасывается в кровь, однако медленнее, чем при введении левомицетина. Препарат не полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта, в связи с чем в кишечнике длительное время сохраняются бактериостатические концентрации. Применяют в тех же случаях и дозах, что и левомицетин, преимущественно при поражениях кишечника.

Левомицетина сукцинат растворимый. Сухая пористая масса белого или белого с желтоватым оттенком цвета со слабым специфическим запахом, горького вкуса. Хорошо растворим в воде.По антимикробному спектру не отличается от левомицетина, поэтому показан при тех же инфекциях, однако вводят его внутримышечно.

Синтомицин. По химическому строению не отличается от левомицетина. Последний является левовращающей формой, а синтомицин представляет смесь из лево- и правовращающих изомеров левомицетина. Антимикробной активностью обладает только левовращающий изомер. Белый или белый с зеленовато-желтоватым оттенком порошок, нерастворим в воде. Антимикробный спектр аналогичен левомицетину, однако активность почти в 2 раза ниже последнего. Поэтому применяют в тех же дозах и при тех же инфекциях, что и левомицетин, но в двойных (по отношению к левомицетину) дозах. Наружно применяют для лечения гнойных ран, гнойно-воспалительных заболеваний кожи и т. д., используя для этих целей линимент или эмульсию.

Антибиотики-полипептиды.

Антибиотики-полипептиды продуцируются некоторыми почвенными бактериями и актиномицетами и по химической структуре это полипептиды с набором различных аминокислот и их остатков. Некоторые полипептиды (полимиксины) обладают свойствами поверхностно-активных веществ, что способствует взаимодействию с фосфолипидами мембран грамотрицательных бактерий и гибели последних. Этот признак в механизме действия очень ценен, так как препараты, воздействующие на цитоплазматические мембраны, способны подавлять рост злокачественных новообразований. Другие полипептиды (ристомицин) подобно пенициллинам ингибируют синтез клеточной стенки бактерий. При этом ристомицин образует комплекс с дипептидом, входящим в состав пептидогликана бактериальной стенки, препятствуя завершению синтеза клеточной оболочки микроорганизмов, что приводит к их гибели.

Полимиксина М сульфат. Природный антибиотик, продуцируемый почвенными бактериями. По химическому строению сложное соединение, включающее остатки полипептидов. Белый или белый с кремоватым оттенком порошок сладкого вкуса, легко растворим в воде. 1 мкг = 8 ЕД.

Действует в основном на грамотрицательные микроорганизмы: кишечную, дизентерийную палочки и палочки брюшного тифа, эффективен и в отношении синегнойной палочки. Малотоксичен при местном применении и при приеме внутрь, так как слабо всасывается из кишечника. При парентеральном введении оказывает нефро- и нейротоксическое действие. Примсняют внутрь при дизентерии, колибактериозе, сальмонеллезе, энтероколитах молодняка животных, в том числе птиц, а также местно при лечении инфицированных ран и ожогов.

Полимиксина В сульфат. Полипептидный антибиотик из группы полимиксинов. Порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета, легко растворим в воде. 1 ЕД = 1 мкг. Антибактериальный спектр аналогичен полимиксину М. Отличие менее токсичен, поэтому применяют внутрь, внутримышечно и интравенозно (капельно). Возможен нефротоксический эффект при инъекциях препарата. Недопустимо совместное применение с антибиотиками группы аминогликозидов и сульфаниламидами из-за усиления нефротоксического действия.

Грамицидин С. Природный антибиотик, продуцируемый различньши споровыми микроорганизмами. По химическому строению пептид, в котором содержится много остатков аминокислот. Порошок, нерастворим в воде, хорошо растворим в спирте. Активен в отношении грамположительной микрофлоры. Применяют ввиду токсичности (возможен гемолиз) только местно в форме водных растворов, которые готовят из спиртового раствора, для обработки гнойных ран и гнойно-некротических поражений кожи, ожогов и др.

Кормовые антибиотики.

Антибиотики стали использовать в качестве ростостимулирующих (эрготропных) средств почти сразу после их появления на медицинской арене, a именно: в начале 50-х годов нашего столетия. При этом в качестве ростостимулирующих средств сначала применяли большинство антибиотиков и лишь впоследствии (в начале 60-х годов) предпочтение было отдано средствам тетрациклинового ряда как наиболее эффективным. В то же время дальнейшее применение этих антибиотиков в качестве ростостимулирующих средств стало сдерживаться, так как они до сих пор используются с лечебными целями, как в

медицинской, так и в ветеринарной практике. К кормовым антибиотикам относятся бацитрацин, гризин, флавомицин, румензин и др.

К кормовым антибиотикам предъявляют требования, обеспечивающие, с одной стороны, активизацию роста животных, с другой не препятствующие снижению лечебной ценности антибиотиков, используемых для борьбы с инфекционными болезнями животных и человека. Кормовые антибиотики должны не только положительно влиять на рост и развитие животных, но и обладать следующими особенностями:

не всасываться в желудочно-кишечном тракте и не загрязнять продукты животного происхождения;

не применяться в лечебной практике;

не обладать способностью образования у микроорганизмов резистентности.

Вполне понятно, что тетрациклиновые антибиотики, применяемые в качестве стимуляторов роста, например биовит, терравит и др., несмотря на превосходные ростостимулирующие свойства, не могут быть отнесены к указанной категории кормовых антибиотиков, хотя до сих пор их применяют в животноводстве.

Антибиотики в стимулирующих дозах (значительно ниже терапевтических) почти на порядок улучшают обмен веществ, координацию физиологических процессов, активизируют защитные реакции и, таким образом, благоприятно воздействуют на развитие, рост и продуктивность животных.

Многочисленными опытами в разных странах установлено, что применение антибиотиков в премиксах, комбикормах и рационах сельскохозяйственных животных открывает болыиие возможности в улучшении использования питательных веществ корма и увеличении производства животноводческой продукции. При добавке кормовых антибиотиков в ростостимулирующих дозах в рационы животным живая масса возрастает на 10-15 %, затраты корма на единицу прироста снижаются на 5-8 %, а отход молодняка сокращается. Благодаря большому экономическому эффекту, полученному при использовании антибиотиков, объем применения их в кормлении животных растет из года в год.

В настоящее время со стимулирующей целью в нашей стране применяются следующие антибиотики:

Бацитрации. Антибиотик открыт Джонсоном и соавторами (1945), является смесыо антибиотических веществ. В настоящее время получено более 10 индивидуальных бацитрацинов: А, А1, В, С и т. д., среди которых бацитрацин А занимает до 37 %. Это белый порошок, хорошо растворимый в воде, этаноле, метаноле, изопропаноле. Чистые препараты имеют антибиотическую активность, достигающую 70 ЕД. Сухой препарат стабилен при температуре 5-37

С в течение 16 мес.

Антибактериальный спектр подобен пенициллину. К бацитрацину чувствительны некоторые грамположительные микроорганизмы, включая пневмококки, стрептококки, стафилококки и клостридии. Эффективен также против грамотрицательных гонококков и менингококков. Нарушает подобно пенициллину процесс формирования стенок микробной клетки, а также синтез белка. Бацитрацин препятствует образованию бактериями токсина в дозах ниже бактериостатического уровня. Иными словами, он в 2 раза сильнее задерживает образование ядовитых выделений бактериями, чем их размножение.

Гризин. Антибиотик-полипептид. Для всех антибиотиков-полипептидов характерно отсутствие в молекуле свободных аминогрупп.Обладает широким спектром антибактериального действия, но относительно слабой активностью. Подавляет рост грамположительных и грамотрицатеяьных бактерий. Проявляет выраженный ростостимулирующий эффект, относительно плохо всасывается из желудочно-кишечного тракта. Поэтому даже при длительном применении откормочным животным антибиотик не обнаруживается в органах и тканях, что очень важно с санитарной точки зрения.

Флавомицин. Кормовой антибиотик, разработанный фирмой «Фарбверке Хехст». Бесцветный порошок, растворимый в воде и спиртах. Лучший кормовой антибиотик, Используется исключительно в качестве добавок в рационы животных. По химической природе фосфорсодержащий гликолипид. Активен в отношении грамположительной микрофлоры. He вызывает перекрестной резистентности к пенициллину, тетрациклинам, хлорамфениколу, стрептомицину и макролидным антибиотикам. По механизму действия тормозит синтез клеточной мембраны бактерий. Практически не резорбируется из желудочно-кишечного тракта и при соблюдении ростостимулирующих доз не обнаруживается в органах и тканях животных. Благоприятны и экологические аспекты при использовании данного препарата. Попав в почву с фекалиями, инактивируется бактериями и грибами. При этом через 6 недель сохраняется примерно 15 % его исходной активности, а через 1012 недель инактивируется полностью. Растения флавомицин не поглощают.

Румензин.

Однако многие ученые отмечают, что антибиотики способны переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц, другие продукты и оказывать токсическое действие на организм человека, поэтому их содержание в продовольственном сырье не допускается. В нормативных документах допустимые уровни содержания антибиотиков приводятся в ед/г, они нормируются для левомицетина (менее 0,01 ед/г), тетрациклиновой группы (менее 0,01 ед/г), гризина (менее 0,5 ед/г) и бацитрацина (менее 0,02 ед/г).

Проблема усугубляется тем, что методы контроля и нормативы разработаны только для немногих из нескольких десятков применяемых препаратов, спектр которых постоянно расширяется.

1.1.5 Использование антибиотиков в ветеринарии и животноводстве.

На антибиотики приходится около 17-20% стоимости всех производимых в мире фармацевтических товаров. опубликованные данные свидетельствуют о том, что в ветеринария и животноводстве используется более половины производимых антибактериальных препаратов. Но если брать в расчет общую численность людей и животных, которым применяются эти лекарства, а также их вес, то на единицу веса человека приходится в 4 раза больше антибиотиков, чем на животных. При наличии систематического, хорошо организованного и эффективного с методической точки зрения контроля за наличием остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства, проводимого на предприятиях мясной и молочной промышленности, а также на рынках, можно было бы ответить на вопросы о том, потребляют ли люди продукты, содержащие остаточные количества антибиотиков. Однако, такого контроля нет в ряде стран, включая и Казахстан.

Различные антимикробные препараты нашли применение и в растениеводстве в качестве гербицидов, инсектицидов, стимуляторов роста. Количество и спектр антибиотиков, применяемых в сельском хозяйстве, из года в год увеличиваются. Столь широкое применение антибактериальных средств в животноводстве и ветеринарии привело к тому, что получаемые продукты животного происхождения зачастую содержат остаточные количества этих продуктов. Проблеме остаточных количеств антибиотиков в продуктах питания, в частности влиянию контаминации ими на здоровье человека и окружающую среду, уделяется внимание практически во всех странах Европы, Англии, Канаде, США уже более 20 лет. Актуальность проблемы определяется тремя аспектами общебиологическим, медицинским и социально экономическим, которые тесно между собой связаны, поскольку массовое применение антибиотиков в медицине, ветеринарии, животноводстве изменяют экологию и биологию микроорганизмов, у которых возникает способность к внехромосомной передаче резистентности к этим препаратам, причем, внутри не, только видов, но и популяций, родов. Имеются мнения, что основной причиной, обусловившей возникновение той картины резистентности, которая наблюдается в клинике, является широкое применение антибиотиков в качестве добавки к кормам. R-плазмидная (внехромосомная) передача лекарственной устойчивости, как в организме людей, так и у животных, в настоящее время хорошо изучена и описана. R-фактор обладает способностью переносить от бактерии к бактерии устойчивость к множеству антибиотиков сразу, а также осуществлять конъюгативный перенос устойчивости от бактерий одного вида к другому. Выявлено 58 штаммов, обладающих трансферабельной резистентностью к триметоприму (сульфаниламиду) и 4 лекарственным препаратам антибиотического происхождения — левомицетину, ампициллину, тетрациклину и спектиномицину.

Проблема резистентности весьма неоднозначна. Наряду с упомянутым внехромосомным путем передачи лекарственной устойчивости у микроорганизмов большое эпидемиологическое значение имеет и селекция устойчивых штаммов в окружающей среде вследствие широкого использования

антибиотиков, а также обсемененности пищеварительного тракта больных людей и животных резистентными микроорганизмами. Под влиянием антибиотиков чувствительные клетки погибают, а резистентные, размножаясь, становятся преобладающей частью микрофлоры. Продолжающееся применение антибиотиков для профилактики и стимуляции роста животных создает значительное селекционное давление и способствует увеличению резистентности к антибиотикам у сапрофитных и патогенных бактерий, длительной персистенции устойчивых штаммов у животных и человека. Совершенно очевидно, что это явление должно сопутствовать практике интенсивного животноводства и птицеводства, где антибиотики применяются систематически.

Описанные явления могут иметь место как в организме животных и человека, так и вне его, в окружающей среде: воде, на продуктах питания, обсемененных резистентными микроорганизмами. Известно, что уровень резистентных популяций выше в больницах, где антибиотики применяются более массово, чем вне них. Это показано, в частности, на примере изучения сточных вод инфекционных стационаров (159, 162). Поскольку эта ситуация имеет аналогию в ветеринарии, да еще подкрепляется систематическим использованием антибиотиков для откорма скота, то совершенно однозначен факт насыщенности стоков от животноводческих ферм и комплексов микроорганизмами с высоким процентом резистентности к антибиотикам с разными типами R-плазмид.

Все это привело к глобальному нарастанию циркуляции в окружающей среде антибиотикоустойчивых штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов — возбудителей заболеваний человека и животных, главным образом сальмонелл, снижению терапевтической эффективности лекарственных средств (170, 225, 242). Закономерно увеличилась длительность диарейных и других заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными возбудителями, они стали протекать более тяжело, возросла необходимость повышать дозы применяемых для лечения препаратов, что неблагоприятно, как с точки зрения токсичности, так и возможности возникновения суперинфекций у людей. Поскольку такие инфекции у людей трудно поддаются лечению, проблема становится наиболее острой для педиатрии и клиники иммунодефицитных состояний, весьма актуальной в настоящее время.

В последние годы определился такой важный аспект проблемы лекарственной устойчивости, как возникновение и персистирование внутрибольничных инфекций. В последнее время все большее значение приобретает повышение уровня сенсибилизированности населения антибиотиками с возможным развитием аллергических реакций, вплоть до анафилактических, при применении антибиотиков больными, сенсибилизированными ранее малыми дозами препаратов. Эта проблема особенно актуальна в педиатрии в связи с увеличением частоты искусственного вскармливания и необходимостью употребления смесей на основе коровьего молока, которое зачастую загрязнено антибиотиками, а также из-за более быстрых нарушений в микроэкологической системе, возникающих при систематическом поступлении в организм, как самих антибактериальных препаратов, так и контаминированной ими пищи, и, как правило, сопровождающихся диатезами. Организм человека может быть сенсибилизирован в результате потребления пищи, содержащей остаточные количества антимикробных препаратов, применяемых в животноводстве и ветеринарии. На такую возможность указывалось еще в конце 60-х годов (174, 223, 286). Это наряду с резистентностью затрудняет терапевтическое применение антибиотиков и, сужает спектр используемых в клинике препаратов из-за возможности развития аллергических реакций у сенсибилизированных больных.

Третий аспект проблемы — социально-экономический — связан со снижением эффективности биотехнологических процессов переработки животноводческих продуктов. Здесь необходимо принять во внимание, что незначительные количества антибиотиков (около 0,015-0,02 ед/г) могут нарушать ход технологических процессов при выработке кисломолочных продуктов, сыров, сырокопченых колбас и т.п. (17, 55, 57, 111). Особенно это актуально для молочной промышленности, так как переработка молока, содержащего остатки антибактериальных, моющеедезинфицирующих веществ, консервантов, приводит к снижению товарного качества, органолептических свойств продуктов и, в конечном счете, к экономическим потерям.

Неблагоприятные последствия применения антибиотиков в сельском хозяйстве привлекли внимание многих исследователей к этой проблеме. Одним из основных направлений работы в разных странах было изучение реальной степени загрязненности продуктов питания антибиотиками, для чего были широко организованы исследования по адаптации методов определения антибиотиков, сульфаниламидов и других антимикробных препаратов в пищевых продуктах. Главными требованиями к этим методам были: пригодность для массового профилактического контроля, доступность реактивов и ингредиентов, отсутствие сложного аппаратного оснащения, возможность проведения скринингового анализа продуктов животноводства практически в любой контрольной лаборатории (3, 12, 27, 50, 69, 94, 166).

Влияние остаточных количеств антибиотиков на результаты ветеринарно-санитарной экспертизы и технологию производства продуктов животноводства

Наличие остаточных количеств антибиотиков в мясе, молоке и других продуктах животноводства влияет на результаты бактериологических исследований, поэтому их определение важно в санитарно-гигиеническом отношении.

Бактериологическому исследованию при ветеринарно-санитарной оценке мяса, молока, яиц и продуктов их переработки принадлежит решающая роль, так как по результатам этих исследований эксперт решает вопрос о возможности использования их для питания людей, направляет на переработку или бракует. В теоретическом плане этот вопрос не вызывает никаких сомнений, поскольку применение антибиотиков с терапевтической, профилактической и даже ростостимулирующей целями основано на способности этих препаратов подавлять рост и размножение различных микроорганизмов, то есть оказывать бактериостатическое действие или, что бывает значительно реже, действовать на микроорганизмы бактерицидно. Поэтому, если в мясе и других продуктах животноводства, инфицированных какими-либо микроорганизмами, содержится тот или иной антибиотик в достаточной для бактериостатического эффекта концентрации, то при бактериологическом исследовании такого продукта можно получить отрицательные результаты, несмотря на то, что по органолептическим показателям продукт не отвечает требованиям.

Если до применения антибиотиков проведение бактериологического анализа не представляло серьезных трудностей, то в период массового применения антибактериальных препаратов нередко отмечаются расхождения между органолептическими показателями и результатами бактериологического исследования. Это доказано как специальными экспериментальными исследованиями, так и на практике.

Впервые о затруднениях, возникающих при экспертизе мяса от больных животных, в анамнестических данных которых отсутствовали сообщения о возможном применении антибиотиков с терапевтической целью, было описано французским исследователем Саму (157). Он указал на несоответствие между обнаружением возбудителей заболеваний в мазках-отпечатках и отрицательными результатами бактериологических исследований мяса этих животных. Кроме того, было установлено наличие нетипичных форм возбудителей в мазках-отпечатках. Указанные несоответствия Саму связывает с применением антибиотиков перед сдачей на убой больных животных, в результате чего даже при явных патологоанатомических изменениях, свойственных септическим процессам, бактериологическое исследование может дать отрицательный результат (157).

О возможном вреде, который могут наносить здоровью человека продукты животноводства, выпущенные в продажу на основании отрицательных результатов бактериологических исследований в связи с бактериостатическим действием антибиотиков, указывают многие исследователи. В случае, когда концентрация антибиотиков в том или ином продукте достаточна для подавления роста микроорганизмов, патогенные бактерии будут находиться в них в очень, небольшом количестве, и в основном особи, обладающие повышенной резистентностью. Размножаться они начнут, в продукте тогда, когда уровень антибиотика станет ниже минимальной бактериостатической концентрации. Так как бактериологическое исследование мяса, молока и других продуктов животноводства проводят обычно вскоре после убоя животных и отбора проб, когда в них содержатся значительные количества антибиотических веществ, то это затрудняет или делает почти невозможной постановку правильного диагноза. Следовательно, при неправильной оценке результатов бактериологических исследований возможен выпуск недоброкачественной продукции.

Имеет практическое значение вопрос о том, влияет ли на результаты бактериологической оценки мяса только использование антибиотиков перед убоем больных животных с терапевтической целью или подобный эффект наблюдается и при применении малых доз препаратов в целях стимуляции роста животных. Для выяснения этого вопроса были проведены экспериментальные исследования на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

В эксперименте на белых мышах (Kalich, Merkenschlager, 1958) (3) установили, что доза хлортетрациклина 80 мг на 1 кг корма не повлияла на результат бактериологического анализа при экспериментальном сальмонеллезе.

Однако увеличение дозы в 3 раза подавляло рост возбудителя на питательных средах в 33 % случаев, причем даже при инкубации в течение трех суток посевов из органов, в мазках которых микроскопией выявлялось обилие сальмонелл. Pacer, Spika, (1989) (243) в опытах на крысах и собаках изучали влияние хлортетрациклина на результаты бактериологического исследования мяса. Они применяли препарат в качестве добавок в корм экспериментальным животным в лечебных и стимулирующих рост дозах. У животных контрольных групп сальмонеллы выделены в 147 пробах из 160 после 18-часовой инкубации в термостате. Также из 160 проб от животных, получавших перед и во время заражения стимулирующую дозу хлортетрациклина положительные результатыбыли в 144 пробах.

В отличие от этого в группах животных, где применяли терапевтическую дозу антибиотика, из 160 проб, после 18-часовой инкубации в термостате положительные результаты отмечены только в 89 случаях, что составляет по сравнению с контрольной группой- 60,5 %. Удлинение сроков выращивания увеличивает процент положительных результатов: через 24 часа выращивания сальмонеллы обнаружили уже в 119 пробах, а через 39 часов в 124, что составило 82,6 и 86 % соответственно по сравнению с контролем.

Мс Namara и др. в опытах на свиньях, в корм которых перед заражением возбудителем рожи вводили террамицин из расчета 50 мг на голову в день, установили отрицательное влияние этой дозы на результаты бактериологического исследования. Отмечали очень скудный рост колоний при высевах из селезенки и лимфатических узлов по сравнению с результатами исследования проб от животных, получавших в корм 1220 мг антибиотика в день, у которых при бактериологическом исследовании не выявлялось никаких
отклонений (227). Авторы считают реальной опасность ошибочных результатов бактериологических анализов при ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков.

Приведенные экспериментальные данные и практические наблюдения, безусловно, свидетельствуют о том, что остаточные количества антибиотиков в мясе, молоке и других продуктах, полученных от животных, которым антибиотики вводили в лечебных или профилактических дозах, затрудняют или делают невозможным правильную оценку результатов бактериологических исследований.

В литературе имеется ряд сообщений о том, что наличие остаточных количеств антибиотиков в молоке и мясе отрицательно сказывается также и при

технологической переработке этих продуктов.

В связи с широким применением антибиотиков для лечения у коров мастита возникли серьезные технологические трудности. Антибиотики изменяют микрофлору и ферменты молока, которые участвуют в процессе изготовления сыров, йогурта, других кисломолочных продуктов. Нарушение технологии переработки молока в результате наличия в нем остаточных количеств антибиотиков может наносить большой экономический ущерб. Craven (163) установил, что для подавления роста культуры йогурта достаточно присутствия 0,02 ЕД/мл пенициллина или 0,001 мкг/мл тетрациклина в молоке. В этом случае становится невозможным производство указанного продукта, а также сыров, кисломолочных продуктов и масла. При производстве сыров концентрация пенициллина 0,050,10 ЕД/мл, а при производстве йогурта 0,01 ЕД/мл, мешают нормальному технологическому процессу или совсем делают невозможным производство этих продуктов (31). По данным Craven (163), рост молочнокислых бактерий чистых культур закваски (Str. cremoris, Str. diacelactis и Leuconostoc citrovorum) подавляется различными антибиотиками даже при низких концентрациях.

Благодаря задержке образования кислоты рН молока остается высоким, что создает благоприятные условия для быстрого роста газообразующих коли-бактерий, которые портят сыр. Образуются посторонние запахи и нарушается структура сыра: возникают большие полости неправильной формы. При использовании чистых культур для изготовления масла и в производстве пахтанья и кисломолочных продуктов, могут возникать те же трудности.

Наличие остаточных количеств антибиотиков не позволяет дать правильную оценку ферментативным процессам и эффективности пастеризации.

Таким образом, приведенные данные убедительно свидетельствуют о необходимости осуществления строгих мер, позволяющих предупредить поступление на перерабатывающие предприятия продуктов животноводства, контаминированных антибиотиками. Кроме того, необходимо учитывать, что номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно обновляется и расширяется.

Характеристика методов определения антибиотиков в продукции животноводства.

Широкое распространение остатков антибиотиков в продуктах животноводства и значительная частота их обнаружения предопределяют необходимость систематического периодического или выборочного контроля. Для определения антибиотиков в продуктах животноводства предложен ряд микробиологических, химических и физико-химических методов. Микробиологические методы позволяют определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы (тест-культур, тест-микробов) и поэтому наиболее специфичны и объективны. С их помощью можно определить наличие всех антибиотиков, содержащихся в продуктах животного происхождения. Эти методы не требуют специального оборудования и могут быть использованы в любой ветеринарной лаборатории.

Различают три микробиологических метода определения антибиотиков: диффузии в агар, турбидиметрический и последовательных разведений. Наибольшее распространение из них получил метод диффузии в агар, основанный на свойстве антибиотиков диффундировать из испытуемого образца в плотную питательную среду, засеянную определенной тест-культурой, и подавлять рост этой тест-культуры. В результате вокруг образца появляется зона задержки роста, свидетельствующая о наличии в нем антибиотика. Величина зоны зависит от химической природы и концентрации антибиотика, чувствительности тест-микроба, состава агаризованной среды, ее рН и других факторов, которые следует учитывать при разработке и практическом применении метода. Строгая стандартизация условий опыта необходима для получения воспроизводимых результатов.

В зависимости от цели исследований при помощи метода диффузии в агар можно проводить как количественное, так и качественное определение антибиотиков. Количественный метод чаще всего используют для определения концентрации и продолжительности нахождения антибиотиков в органах, тканях и биологических жидкостях после экспериментального введения животным различных препаратов. Эти данные позволяют вырабатывать рекомендации в отношении сроков убоя животных или получения других продуктов (молока, яиц) после применения антибиотиков. В практических условиях при ветеринарно-санитарном контроле продуктов животного происхождения в ряде стран чаще используют относительно простые и более доступные качественные методы определения антибиотиков.

Количественные и качественные методы исследования применяют также при изучении способов разрушения антибиотиков в этих продуктах под действием различных факторов.

Полученные данные при экспериментальных исследованиях, а также в практических условиях о содержании антибиотиков в продуктах животного происхождения являются тем ценным материалом, который используется для выработки различных законодательных предписаний, регламентирующих применение антибиотиков.

Количественные методы. Количество антибиотика устанавливают путем сравнения величин зон задержки роста (ингибиции), образуемых испытуемым образцом и стандартным препаратом известной концентрации. Анализ складывается из следующих основных операций:

А) выращивание тест-культур и приготовление микробной взвеси;

Б) подготовка чашек со средой и тест-культурой;

В)приготовление растворов рабочего стандарта и построение стандартной кривой;

Г) подготовка испытуемого материала;

Д) постановка опыта и расчет концентрации антибиотика.

Качественные методы. Для качественного определения остатков антибиотиков предложено много методов. Они разнятся по чувствительности, сложности выполнения и длительности проведения анализа, а также по возможности выявления одного или сразу нескольких антибиотиков. Последняя особенность имеет важное значение в том случае, когда заранее неизвестно, какой антибиотик может находиться в исследуемом продукте.

В отличие от количественных методов качественное определение антибиотиков не предусматривает построения стандартной кривой и расчета концентрации антибиотика в испытуемом материале. При подготовке чашек Петри или лотков со средой и тест-культурой не всегда пользуются лунками. Вместо них часто применяют пропитанные исследуемым материалом бумажные диски. В том случае, если в испытуемом образце предполагается высокая концентрация антибиотика, в каждой чашке вырезают не более четырех лунок или на поверхность агара накладывают не более четырех дисков.

Подготовку испытуемого материала проводят различными методами, способствующими лучшему извлечению антибиотика, а также его концентрированию, когда предполагается незначительное содержание этого вещества, лежащее за пределами чувствительности тест-микроба.

Ускорение результатов анализа достигается тем, что чашки инкубируют в термостате минимальное количество времени, обеспечивающее появление заметных зон задержки роста, которые свидетельствуют о присутствии антибиотика в испытуемом материале.

До последнего времени применялись практически только микробиологические методы, основанные на том, что при действии антибиотика тормозится рост микроорганизмов и угнетаются их метаболические функции. Это можно определить по изменению кислотности молока при сквашивании молочнокислыми бактериями. Предложен ряд методов, использующих диффузию антибиотика в агар: препарат проникает в агар и задерживает рост внесенного в него тест-микроба, при этом образуются четкие зоны задержки роста, размер которых соответствует концентрации ингибитора. Описаны варианты этого метода с использованием лунок, дисков, цилиндров и др. Микробиологические методы обладают высокой чувствительностью, но малоспецифичны, дают трудновоспроизводимые результаты, зависят от условий их выполнения, требуют значительного времени и плохо поддаются стандартизации (59, 164, 207, 244, 273), однако являются наиболее массовыми и доступными.

Сегодня все чаще находят применение современные высокочувствительные и эффективные иммунохимические и физико-химические методы определения антибиотиков в продуктах.

В применяемых способах только в незначительной степени использованы возможности идентификации и детектирования антибиотиков, имеющих, как правило, активные функциональные группы, способные образовывать соединения, легко обнаруживаемые по поглощению ультрафиолетового света, интенсивно окрашенные и/или флуоресцирующие (59, 60). В то же время достижения современного функционального микроанализа органических веществ, в частности, с помощью реакционных хромато-спектрометрических методов позволяют решать задачу избирательного определения многих соединений с активными функциональными группами, содержащихся в сложных смесях в очень малых количествах (60). Реакционные методы, существенно расширяющие возможности традиционных хроматографических способов, нашли широкое практическое применение для анализа различных органических веществ в окружающей среде, фармакологии, медицине. Особенно перспективным представляется их использование для определения следовых количеств различных соединений в пищевых продуктах и кормах (59, 60).

Сочетание химических реакций получения легко детектируемых соединений, высокой разрешающей способности хроматографии с большими идентификационными возможностями спектрометрии позволяют проводить анализ реакционноспособных органических соединений на нанограммовом уровне.

Способы извлечения пенициллинов из продуктов наиболее подробно разработаны для последующего определения с помощью биологических методов. Так, твердые продукты после тщательного измельчения, а молоко непосредственно обрабатывают буферными растворами, выдерживают при температуре 29-37С в течение 1-1,5 ч, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для, анализа (176, 197, 210, 231, 261).

Предложено также много вариантов с применением органических растворителей. Продукт обрабатывают ацетоном, фильтруют и экстрагируют хлористым метиленом или хлороформом (59, 267, 270). При необходимости можно провести обезжиривание продукта петролейным эфиром (595, 274).

Кроме ацетона для депротеинизации используют ацетонитрил или трихлоруксусную кислоту (59, 188, 192).

Экстракция пенициллинов из образцов может производиться с помощью колоночной хроматографии, например на Sep-Pak с 18 с последующим элюированием смесью хлороформ-этилацетат или водой и метанолом (59, 274). Для обнаружения пенициллинов в продуктах животноводства применяют различные варианты микробиологических методов. Наиболее распространены методы, использующие диффузию этих антибиотиков в агар и определение их концентрации по величине зон торможения роста тест-культур, обладающих высокой чувствительностью к этому классу антибиотиков. В качестве тест- культур рекомендуются Вас. stearothermophilus var. calidolactis: АТСС 10149, С 953, Вас. subtilis АТСС 6633 и др.(191, 197, 234).

Для пенициллинов, а также для других антибиотиков созданы и продолжают разрабатываться химические и физико-химические методы обнаружения и количественного определения их в различных биологических средах. Наиболее простыми и легко выполнимыми являются групповые методы, основанные на проведении соответствующих химических реакций, в результате которых образуются интенсивно окрашенные соединения (59, 275

Набор реакций определяется химическим строением молекул пенициллинов и их химическими свойствами, что обеспечивает обнаружение этих антибиотиков. В то же время это предопределяет их недостаточную специфичность, что необходимо учитывать при проведении анализа. Так, при щелочном гидролизе происходит расщепление лактонового и тиазолидинового колец. Образующаяся пенальдиновая кислота и пеницилламин легко окисляются йодом, что используется для количественного определения пенициллинов (59).

Энзиматическое или гидролитическое разложение пенициллинов приводит к образованию 6-аминопенициллиновой кислоты, которая в результате взаимодействия с йодистым калием и крахмалом дает окрашенные соединения. Аналогично реагируют и цефалоспорины. Этот же способ может быть использован для обнаружения пенициллинов после их разделения с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) (59).

Пенициллины и цефалоспорины способны взаимодействовать с гидроксиламином с образованием производных гидроксамовой кислоты, которые с хлорным железом дают пурпурную окраску.

Пенициллины можно определить после их гидролитического превращения (по -NH группе) по образованию окрашенных соединений. Эти антибиотики могут быть обнаружены также (по — СООН группе) с помощью метаванадата аммония. Описаны и другие групповые способы определения пенициллинов и цефалоспоринов (59).

Некоторые реакции применяют для обнаружения отдельных представителей [3-лактамных антибиотиков. Так, при обработке раствором хромотроповой кислоты в концентрированной серной кислоте пенициллины дают различные окраски, например, бензил коричневую, а феноксиметил-фиолетовую. Примесные вещества могут искажать результаты определения. Пенициллины, имеющие свободные первичные аминогруппы, например ампициллин, образуют окрашенные соединения с нингидрином, с 4-диметиламинокоричным альдегидом и солями меди (59).

Разработано значительное число микрометодов определения органических соединений, содержащих те или иные реакционно-способные функциональные группы, основанных на образовании легко детектируемых соединений, обладающих интенсивной окраской, хорошо поглощающих ультрафиолетовые лучи и/или флуоресцирующих. С этой точки зрения большой интерес представляют продукты разложения пенициллинов и цефалоспоринов. Для анализа соединений, содержащих первичные и вторичные аминогруппы, предложено большое число реакций и реагентов. Наиболее широко для этой цели применяются реакции ацилирования и бензоилирования, которые обычно проводят при повышенных температурах в присутствии катализаторов - неорганических оснований, третичных аминов, краунэфиров и др. В качестве ацилирующих агентов чаще других используют галоген ангидриды ароматических карбоновых и сульфокислот (59, 60).

К сожалению, пригодность подавляющего большинства таких методов, разработанных для микроопределения органических веществ, содержащих активные ИН2-, NH=, -СООН и -SH группы, для анализа пенициллинов еще не установлена. Применение ряда уже предложенных реакций для определения пенициллинов в экстрактах из объектов затруднено вследствие наличия в них веществ, мешающих определению. В связи с этим в последнее время большое внимание уделяется хроматографическим и хроматоспектрометрическим методам определения антибиотиков в продуктах. Наиболее часто применяется ТСХ, отличающаяся простотой и удобством выполнения, доступностью оборудования и достаточной эффективностью определения пенициллинов (59, 192).

Предложено значительное число различных способов выполнения ТСХ пенициллинов. Как правило, ее проводят на силикагеле или силуфоле: в ряде случаев используют для этой цели целлюлозу, оксид алюминия и др. Для улучшения разделения иногда применяют двумерную ТСХ.

Визуализацию разделенных веществ проводят в большинстве случаев непосредственно на хроматограмме путем опрыскивания (или погружения) растворами различных химических реагентов (хлорное железо и красная кровяная соль в серной кислоте, азид натрия и йода, перманганат калия, пары йода и др.), в результате реакций с которыми на пластинке образуются окрашенные соединения.

При необходимости после проведения разделения соответствующие зоны могут быть экстрагированы растворителями. В этом случае экстракты обрабатывают подходящими реагентами и измеряют интенсивность окрашивания или флуоресценции.

В ряде случаев предлагается проводить визуализацию разделенных веществ, путем наложения пластинки или ее отпечатка на слой агара, содержащего соответствующую тест-культуру с последующим измерением зон торможения.

В последнее время для определения пенициллинов широко применяется и высокоэффективная жидкостная хроматография, для которой разработано много вариантов ее проведения. Предпочтение отдается, как правило, обращеннофазной хроматографии. Иногда пенициллины перед проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии гидролизуют, хроматографируют продукты гидролиза и обрабатывают их альдегидом.

Для обнаружения веществ после разделения часто применяют УФ - детекторы с максимумами поглощения в области 220-254 нм, однако, учитывая, что пенициллины слабо поглощают свет в ультрафиолетовой области, предел обнаружения находится на уровне микрограммовых количеств. При необходимости повышение чувствительности может быть достигнуто путем получения легко детектируемых производных.

Определение пенициллинов в биологических объектах с помощью газожидкостной хроматографии проводится редко. Как правило, пенициллины предварительно метилируют или силируют (59). Газожидкостная хроматография требует обслуживания квалифицированным персоналом.

Для любого метода определения антибиотиков необходима предварительная пробоподготовка, позволяющая максимально извлечь исследуемое вещество из изучаемого субстрата.

Способы извлечения антибиотиков из исследуемых образцов наиболее подробно разработаны для последующего определения с помощью биологических методов. Так, твердые продукты после тщательного измельчения, а молоко непосредственно обрабатывают буферными растворами, выдерживают при температуре 29-37

С в течение 1-1,5 ч, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для анализа. Предложено также много вариантов с применением органических растворителей. Продукт обрабатывают ацетоном, фильтруют и экстрагируют хлористым метиленом или хлороформом. При необходимости проводят обезжиривание продукта петролейным эфиром. Для протонизации кроме ацетона используют ацетонитрил или трихлоруксусную кислоту.

Широкое применение антибиотиков в животноводстве и ветеринарии создает определенные проблемы с точки зрения гигиены питания, технологии производства, экологии, в связи, с чем необходимо строгое соблюдение определенных правил с целью снижения уровней загрязненности молока и молочных продуктов лекарственными средствами, а также организация контроля за остаточными количествами антибиотиков в этих продуктах.

Кормовые смеси, обогащенные антибиотиками, не следует использовать в рационах дойных коров, а молоко, полученное от животных, прошедших курс лечения, перед использованием целесообразно контролировать на наличие остаточных количеств этих лекарственных средств.

В связи с интенсификацией сельскохозяйственного производства правильный, своевременный и надежный контроль качества животноводческой продукции приобретает особое значение. Целесообразно введение дифференцированных штрафов за поставку продукции, загрязненной антибиотиками, запрещенными к использованию в ветеринарии, а также в случае установления превышения МДУ антибиотиков, разрешенных к применению. Поставка загрязнённого животноводческого сырья должна стать экономически невыгодной.

Необходима строгая стандартизация методов анализа антибиотиков. В связи с этим целесообразно создание простых и надежных химических способов, подвергающихся метрологической характеристике. Своевременный и надежный контроль антибиотиков позволит гарантировать выпуск продуктов здорового питания, свободных от присутствия лекарственных препаратов и отвечающих требованиям стандартов по качеству и безопасности.

Комплексный подход к проблеме загрязнения животноводческой продукции остаточными количествами антибиотиков призван не допустить потребление населением нашей страны пищевых продуктов, которые могут служить источником развития аллергических реакций, дисбактериозов и других неблагоприятных явлений.

Собственные исследования

Материалы и методы

При микробиологическим исследовании для определения остаточного количества антибиотиков в продукции животноводства критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам считали минимальную концентрацию антибиотика, которая подавляла рост испытуемой тест-культуры при стандартных условиях постановки опыта. Основные растворы антибиотиков готовили из очищенных стандартных образцов препаратов, содержащих строго определенное количество микрограммов или единиц действия в 1 мг.

Метод ВЭЖХ основан на применении жидкостной экстракции антибиотика из биологических проб, осаждении, очистке и концентрировании экстрактов на концентрирующих патронах.

Для исследований были использованы следующие реактивы, приборы:

ацетонитрил, Ту 6-09-3534-84; тетрагидрофуран ТУ 6-02-621-81; этиловый спирт; натрий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 245-76; калий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 245-76; фосфорная кислота 70%; соляная кислота концентрированная; колонка обращеннофазная "Тесен С18", (150x3) мм, зернение сорбента 7 мкм; весы технические; магнитная мешалка ММ-4; центрифуга ЦУМ-1; колбы конические; пипетки ОД-10 мл; шприцы одноразовые 1-10 мл; микрошприцы 10 мкл, МШ-10; цилиндры мерные 100 мл; скальпели; пинцеты.

Использовали метод пробоподготовки образцов: по МУ 4.1.1912-04.

Пробоподготовка по МУ 4.1. 1912-04: навеску мяса из 2 г тщательно измельчали ножницами, помещали в коническую колбочку на 100 мл и добавляли в нее для экстракции 4 мл фосфатного буфера (0,36 г натрия фосфорнокислого: однозамещенного и 0,34 г калия фосфорнокислого однозамещенного, растворенных в 100 мл воды, рН 6,8) и 0,3 мл 0,01 н раствора соляной кислоты.

Смесь в колбочке встряхивали: на магнитной мешалке в течение 10 минут и переносили в пенициллиновые флаконы для центрифугирования. Центрифугировали экстракт: трижды по 10 мин., каждый раз сливая надосадочную жидкость в одну емкость, а к осадку приливая новую порцию буфера и соляной кислоты в указанном выше объеме. Объединенную надосадочную жидкость с помощью шприца медленно продавливали через подготовленный патрон. Патрон сушили, пропуская через него азот. Остаток органической фазы из патрона выдували азотом. Осадок растворяли в 0,2 мл фазы и анализировали методом ВЭЖХ.

1.2.1 Определение остаточных количеств антибиотиков методом иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологическим методом в сравнительном аспекте

Загрязнение пищевых продуктов является частью глобальной экологической проблемы. Анализу продуктов питания и снижению содержания в них загрязняющих веществ значительное внимание уделяют Всемирная организация здравоохранения, международные организации, занимающиеся вопросами продовольствия, защиты окружающей среды. Это объясняется тем, что доказано канцерогенное, мутагенное, аллергенное действие чужеродных химических веществ, попадающих различными путями в пищевые продукты.

Загрязнители могут быть естественного происхождения (алкалоиды, биогенные амины и др.), биогенной природы (микотоксины, микробные токсины и др.) или результатом деятельности человека (нитрозамины, полициклические ароматические углеводороды, лекарственные препараты и др.). К последней группе относятся антибиотики, обнаруживаемые в мясе птицы, говядине, свинине, в молоке, сыре, яйцах, рыбе и т.д.

Антибиотики являются одной из важнейших групп лекарственных препаратов. В настоящее время объем их ежегодных продаж на мировом рынке превышает 20 миллиардов евро. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками антибиотиков, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов.

Проблема загрязнения пищи антибиотиками возникла вследствие достаточно широкого их использования в ветеринарии и животноводстве, а также при хранении и технологической переработке ряда продуктов. Кроме нежелательного воздействия на человека остаточные количества антибиотиков, могут мешать проведению ветеринарно-санитарной экспертизы, выполнению рада технологических операций, ухудшать качество готовых продуктов, что предопределяет необходимость проведения выборочного или систематического их контроля.

Во многих странах, в том числе и в РК, существует контроль загрязненности пищевых продуктов антибиотиками. Результаты исследований, полученные в ряде стран, представляют определенный интерес для оценки распространенности остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах. Наибольшая частота загрязнения молока антибиотиками зафиксирована в Южной Корее, Ирландии, Египте. В этих странах антибиотики выделяли из 3,7 - 18 % проб. Реже антибиотики в молоке обнаруживали в Дании, Австрии, Швейцарии - в 0,01 - 0,03 % проб.

Наиболее распространены микробиологические методы определения, основанные на том, что в присутствии антибиотиков тормозится рост микроорганизмов, и угнетаются их метаболические функции. Эти методы носят качественный или полуколичественный характер, требуют значительного времени, могут использоваться для скрининговых исследований, но, к сожалению, они непригодны для определения ряда токсичных метаболитов антибиотиков.

ГОСТом определены два микробиологических метода - чашечный с культурой Bacillus stearothermophilus и метод с индикатором бромкрезолпурпуром.

Чашечный метод основан на способности антибиотиков диффундировать в агарозную среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Чувствительность этого теста составляет для бензилпенициллина 0,005 Ед/г, эритромицина - 0,05 Ед/г, левомицетина - 2,5 Ед/г.

Метод с индикатором бромкрезолпурпуром основан на изменении окраски агаровой среды, содержащей споры Bacillus stearothermophilus, от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом субстрате антибиотиков.

Если антибиотики присутствуют в субстрате, окраска остается фиолетовой. Чувствительность этого метода составляет для бензилпенициллина 0,005 Ед/г, эритромицина - 0,25 Ед/г, левомицетина - 7,5 Ед/г. К недостаткам этого метода можно отнести неспособность дифференцировать ингибирующие вещества и меньшая чувствительность по сравнению с чашечным методом.

В последнее время большое внимание уделяется хроматографическим методам, как более чувствительным, позволяющие определить остаточные количества антибиотиков на уровне нескольких миллиграммов на килограмм. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии надежны и высокоэффективны, пригодны для серийных определений на уровне лабораторий по контролю за качеством пищевых продуктов.

Наиболее часто применяют тонкослойную хроматографию на силикагеле или пластинах "Силуфол", где подвижная фаза - смесь различных растворителей. Пластину обрабатывают непосредственно в хроматографе опрыскиванием растворами различных химических реагентов или погружением в них. В результате реакции образуются подкрашенные соединения. После разделения соответствующие зоны могут быть экстрагированы растворителями с последующей обработкой подходящими реагентами и измерением интенсивности образовавшихся окрасок или флюоресценции.

Метод тонкослойной хроматографии имеет предел чувствительности 0,5 мкг пенициллина, 1 мкг окситетрациклина, 2 мкг стрептомицина, наносимых на хроматограмму. Тем не менее, для методов, основанных на хроматографическом разделении, необходимо разработать способы извлечения и идентификации наиболее часто встречающихся антибиотиков; пути адсорбции антибиотиков из биологического материала при совместном присутствии препаратов разных групп; изучить возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в области определения малых доз исследуемых препаратов; усовершенствовать схемы, позволяющие использовать хроматографию в арбитражных и мониторинговых исследованиях.

Хроматографические методы высокочувствительны, но для них требуется дорогостоящее оборудование, для определения каждой группы антибиотиков необходимо подбирать соответствующие реагенты и проводить идентификацию, которая требует высокоочищенных соединений.

Важной и актуальной является разработка методов, основанных на определении следовых количеств антибиотиков и их различных соединений, обнаруживаемых по поглощению ультрафиолетового света, интенсивному окрашиванию, флюоресценции.

Наиболее простыми и легко выполнимыми являются групповые методы, основанные на проведении соответствующих химических реакций, в результате которых образуются интенсивно окрашенные соединения. Набор реакций определяется химическим строением молекул антибиотиков и их химическими свойствами, что обеспечивает обнаружение этих антибиотиков. Например, пенициллины после энзиматического или гидролитического разложения способны давать окрашенные соединения с солями меди, с йодистым калием и крахмалом. Аналогично реагируют и цефалоспорины. Пенициллины и цефалоспорины способны взаимодействовать с гидроксиламином с образованием производных гидроксамовой кислоты, которые с хлорным железом дают пурпурную окраску. Эти антибиотики могут быть обнаружены также (по - СООН группе) с помощью метаванадата аммония. Описаны и другие групповые способы определения пенициллинов и цефалоспоринов (6,15).

Тетрациклины благодаря наличию фенольной группы образуют окрашенные соединения с хлорным железом, монохлорамином и др. Для обнаружения их в продуктах можно использовать многочисленные методы определения фенолов. Тетрациклины способны реагировать с концентрированной серной кислотой, образовывать комплексы с солями аммония, некоторых тяжелых металлов, например, цинка и меди, причем различные тетрациклины дают соединения, окрашенные в разные цвета, что может применяться при идентификации (15). Также ведутся работы в направлении разработки и применения люминесцентного метода, основанного на различном свечении проб, содержащих и не содержащих антибиотики.

Разработан и оптимизирован метод твердофазного иммуноферментного анализа для количественного определения хлорамфеникола в диапазоне концентраций 0,1-100 нг/мл (75). Кроме вышеизложенных методов определения остаточных количеств антибиотиков используются также методы иммунохимического анализа, которые обеспечивают высокую чувствительность, специфичность, точность, являются относительно дешевыми, но требуют сложной пробоподготовки и инструментальной базы, а также радиоиммунологический анализ, применение которого ограничивается необходимостью работы с радиоактивными изотопами.

Таким образом, проблема определения содержания антибиотиков в продуктах животноводства решается разными путями, новизна ее не утрачена.

В этой связи специалистам необходимо выработать единую концепцию и подходить к применению лекарственных препаратов по принципу строжайшего контроля их использования во всех отраслях сельского хозяйства и пищевой промышленности.

Изучение степени загрязнения остаточными количествами антибиотиков в продуктах животноводства

В эпоху технического прогресса, характерного для нашего времени, значительно возросла актуальность научных исследований, направленных на предупреждение загрязнения продуктов питания.

Особую актуальность в гигиене питания приобрела проблема содержания в сырье и продуктах антибиотиков. Оборот на потребительском рынке загрязненной антибиотиками продукции приводит к систематическому

употреблению продуктов питания, содержащих не только антибиотики, но и их метаболиты.

Большинство специалистов связывают попадание антибиотиков в пищевые продукты с широким применением лечебных, лечебно- профилактических и ростостимулирующих средств для сельскохозяйственных животных и птицы, а также с использованием антибиотиков для удлинения сроков хранения продуктов питания.

При термической обработке пищевых продуктов не происходит полного разрушения остатков антибиотиков. Понижение температуры также не обеспечивает инактивацию антибиотиков.

Накопление остаточных количеств антибиотиков приводит к повсеместному увеличению числа резистентных к ним штаммов микроорганизмов, что затрудняет использование антибиотиков для лечения заболеваний человека и животных. У людей возможны аллергические реакции и дисбактериозы. Остаточные количества антибиотиков в сырье нарушают технологию изготовления пищевых продуктов.

Исследования безопасности продуктов должны проводиться в соответствии с правилами лабораторной практики, в результате чего информация о безопасности будет постоянно находиться под контролем ветеринарных специалистов, отвечать изменяющимся стандартам по токсикологии, а также гарантировать безопасность для потребителей.

В силу чрезвычайной важности и глобального характера проблемы контроля за остатками ксенобиотиков (антибиотиков и др.) в пище в законодательстве развитых стран наблюдается тенденция ужесточения требований к контролю за содержанием этих веществ в пищевом сырье, расширению перечня контролируемых показателей, снижению предельно допустимых остаточных уровней этих препаратов.

В целях скрининга и в рутинной лабораторной практике широко применяется более удобный иммуноферментный метод анализа (например с сентября 1998 г. в Германии ИФА является официальным методом скрининга

остатков левомицетина в молоке). В основе процедуры иммуноферментного анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Для количественного определения антибиотиков в продуктах питания использован принцип твердофазного конкурентного ИФА на полистироловых планшетах, который базируется на конкуренции свободного антибиотика из измеряемой пробы и антибиотика, предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к антибиотику антител.

Для выполнения анализа исследуемые образцы, препарат, содержащий антитела к антибиотику и препарат, содержащий конъюгат антибиотика с ферментом, дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета молекулы антибиотика и конъюгата, конкурируя между собой, связываются антителами к антибиотику. При инкубации происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами "захвата" на поверхности.

Определение остаточных количеств тетрациклина в молоке методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы RIDASCREEN Тетрациклин

Тетрациклины представляют собой группу антибиотиков широкого спектра антибактериального действия. Часто используются в ветеринарии для лечения бронхопневмоний, дизентерии, гастроэнтерита, сепсиса, кокцидиоза, пуллороза, пастереллеза и других болезней. Кроме того, тетрациклины являются стимуляторами роста животных. В качестве тест- системы использовали набор реагентов RIDASCREEN Тетрациклин.

В основе метода иммуноферментного анализа на тетрациклин лежит такой же принцип, как и при исследовании на левомицетин.

Подготовка проб по методике МУ 4.1.1912-04. Охлажденное молоко центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об./мин. Затем удалили верхний слой жира и смешали пробу с буфером 2 в соотношении 1:10. В лунку планшета вносили 50 мкл пробы.

Ход анализа и определение количества тетрациклина в пробах молока аналогичен таковым при определении левомицетина.

Результаты определения содержания тетрациклина в молоке методом ИФА с использованием тест-системы RIDASCREEN Тетрациклин представлены в таблице.

Пробы молока и жидких молочных продуктов по 10 мл вносили в колбочки на 50 мл и добавляли 10 мл буфера (2%-ный р-р пепсина на цитратно-солянокислом буфере рН 5,0-5,2). Пробы помещали на 90 мин. в термостат при 37

С для экстракции антибиотиков, периодически применяя ручное встряхивание. После экстракции пробы переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 мин.

Определение остаточных количеств левомицетина и тетрациклина в говядине, свинине и молоке методами ИФА, ВЭЖХ и микробиологическим методом в сравнительном аспекте.

Качество и безопасность пищевых продуктов, поступающих к потребителю, во многом зависят от методов лабораторного исследования. Остаточные количества антибиотиков не должны присутствовать в продуктах питания человека. Поэтому должны развиваться как качественные, так и количественные методы определения антибиотиков.

Основными количественными методами в лабораторной практике являются микробиологический метод, метод иммуноферментного анализа, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Их эффективность зависит от оптимизации способов экстракции антибиотиков, их очистки и самой процедуры анализа. С цель сравнения чувствительности методов, времени, которое необходимо для получения результатов исследования, трудоемкости процессов мы определяли левомицетин и тетрациклин тестированием одних и тех же образцов мяса и молока методами ИФА, ВЭЖХ (МУК 4.1.1912-04) и микробиологическим методом (МУК 3049-84).

Образец

Буфер, центрифугирование М/б метод

Водная фаза, этилацетат, изооктан ИФА

Центрифугирование, насыщенный р-р

поваренной соли, петролейный эфир ВЭЖХ

Результаты исследований представлены в соответствие с таблицей 6.

Заключение

Антибиотики и другие антибактериальные вещества (сульфаниламиды, нитрофураны) широко используются при выращивании сельскохозяйственных животных и домашней птицы. Антибиотические препараты, добавляемые в низких концентрациях (до 50г на 1т корма), увеличивают привес животных и эффективность корма. Их применяют достаточно широко. Например, в США более половины производимых антибиотиков используют для сельскохозяйственных целей и около 80 % мяса получают от животных, в корм которых добавляют антибактериальные и лекарственные вещества.

Полученные данные о положительном влиянии стрептомицина и хлортетрациклина на рост цыплят были подтверждены в последующем на различных видах животных и послужили основанием для широкого применения различных антибиотиков и их комбинаций в практике выращивания животных. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эффект от добавления к корму антибиотиков значительно варьирует и зависит от многих факторов, влияющих на общий статус организма животных. Обычно увеличение привеса достигает нескольких процентов по сравнению с контрольным уровнем, а иногда вообще отсутствует. Даже при добавлении в корм одного и того же антибиотика повышение привеса колеблется от 1,6 до 19 % (Качанова С. П., Павлов В., 1971).

Показано, что кормовые антибиотики эффективны в тех случаях, когда животные получают качественно неполноценный рацион, содержатся в плохих санитарных условиях и грязных помещениях, находятся в предклиническом или клиническом периоде заболевания; кроме того, они эффективны лишь в отношении растущих животных. При хорошем санитарном содержании животных и полноценном кормлении действие антибиотиков на рост не проявляется. Антибиотики вызывают торможение роста возбудителей инфекции, уменьшение образования токсических продуктов жизнедеятельности микробов и подавление непатогенной микрофлоры кишечника. Применение столь активных в биологическом отношении веществ требует особой осторожности и необходимости соблюдения определенных условий, чтобы поступающие в организм животного вещества могли полностью элиминировать из тканей и органов. Абсолютно недопустимо превышение установленного уровня добавки антибиотиков и сокращение срока, так называемого периода ожидания

перед убоем, в течение которого животные получают корм без антибиотиков и из организма выводятся поступившие вещества. Соблюдение этого условия

особенно важно, поскольку в большинстве стран, в том числе в РК, при обычной экспертизе мясных продуктов не исследуют остатки лекарственных

препаратов.

Длительность периода ожидания определяется скоростью метаболизма и полнотой экскреции использованных средств. Дольше всего задерживаются в организме антибиотики, введенные внутримышечно, следовательно, для предупреждения попадания антибиотиков в мясные продукты требуется тщательное выполнение предписаний относительно убоя леченных животных.

Между тем, практика показывает, что контаминация животноводческих продуктов антибиотиками имеет место. Исходя из литературных данных и собственных исследований, степень загрязненности антибиотиками сырья и продуктов, предназначенных для питания, характеризуется различными величинами (от невыявления до 100% положительных проб). Это объясняется в первую очередь различным спектром определяемых веществ, разными объемами выработки, различной чувствительностью применяемых методов. В связи с этим можно заключить, что проблема остаточных количеств антибиотиков очень актуальна. Во всех странах, где подобный контроль проводится, имеют место положительные результаты обнаружения остаточных количеств антибиотиков и других антибактериальных средств в продуктах питания. Причем загрязненность ими отмечается практически во всех видах животноводческой продукции (мясные, молочные продукты, птица, яйца), в рыбе, мёде, зерне, овощах и фруктах.

Наиболее частое загрязнение продуктов животноводства наблюдается при получении их от молодых животных, что связано с добавлением в корма ростостимулирующих средств и антибиотиков для профилактики контактных

заболеваний молодняка. Еще более высокая загрязненность наблюдается в продуктах убоя птицы, что, видимо, связано с интенсивными технологиями ее выращивания и необходимостью за более короткие сроки откорма вводить

большие дозы антибиотиков в пересчете на живой вес птицы. А учитывая практически повсеместное эпизоотическое неблагополучие при больших скоплениях птицы на специализированных комплексах, профилактического назначения антибиотиков и химиопрепаратов здесь избежать невозможно.

В то же время мясо молодых животных и птицепродукты относятся к категории диетических продуктов питания. В еще большей степени это относится к молоку, поскольку этот продукт является основной, практически

ежедневной пищей детей, пожилых людей.

Невозможно также избежать добавления антибиотиков в лед для хранения рыбы при ее транспортировке в условиях экспедиционного лова.

По той же причине обнаруживаются антибиотики на - поверхности импортируемых в нашу страну овощах и фруктах. Растворами антибиотиков продукция орошается для удлинения сроков ее хранения.

Оценка безопасности продуктов питания очень сложна из-за разнообразия соединений и различного их применения, а также потому, что лекарственные препараты, предназначенные для животных, в отличие от других пищевых добавок фармакологически активны. Количества, которые попадают в организм человека, могут содержать не только остатки первичного соединения, но и остатки различных метаболитов.

Остатки некоторых лекарственных препаратов удаляются довольно быстро, причем содержание их в съедобной ткани может быть очень мало или отсутствовать совсем. Остатки других препаратов могут длительно персистировать, накапливаясь в органах и тканях. Места преимущественной концентрации остатков (первичного соединения и метаболитов) также могут быть различны (мышечная ткань, печень, почки и т. д.).

Подсчитано, что в США почти 100 % птицы, 90 % свиней и телят, 60 % крупного рогатого скота получают с кормом антибактериальные добавки и 70% говядины вырабатывается из скота, которому скармливали добавки для увеличения массы (102). Достоинства препаратов для животных совершенно очевидны, однако возникают споры по поводу риска, который они представляют для людей.

Беспокойство при внесении антибактериальных препаратов в корм скоту вызвано риском, связанным главным образом с увеличением количества устойчивых бактерий, а также с остатками лекарств и метаболитами, которые могут быть канцерогенными для потребителя.

Уже в первые годы применения антибиотиков было отмечено увеличение числа резистентных штаммов при кормлении свиней и цыплят террамицином. В дальнейшем это неоднократно подтверждалось.

Первоначально полагали, что развитие резистентных штаммов обусловлено спонтанной мутацией и отбором. В последующие годы было открыто явление переноса устойчивости от одного микроорганизма к другому путем прямого контакта, в результате чего внутриклеточные элементы от донорской клетки передают устойчивость клетке-реципиенту и обе становятся резистентными к антибактериальным веществам. Этот феномен, известный как перенос лекарственной резистентности (R-фактор), был достаточно изучен и описан. Подробно изучена молекулярная природа R-фактора. Принципиальная особенность R-фактора - способность переноса устойчивости к множеству антибактериальных веществ. Донорское вещество содержит до 7 генов, несущих лекарственную устойчивость. R-фактор является наиболее важным элементом, ответственным за перенос устойчивости к тетрациклину, хлорамфиниколу, стрептомицину, ампициллину, сульфаниламидам.

Способность к переносу (R-фактор) может рассматриваться как серьезный фактор загрязнения окружающей среды, и человек вносит определенный вклад в это загрязнение. Широко распространенная резистентность среди бактерий уже сейчас создает трудности при лечении человека и животных.

Другим наиболее важным результатом побочного действия антибиотиков является сенсибилизация организма человека к одному или нескольким антибиотикам.

Ответные реакции после поступления минимальных количеств антибиотиков имеют разную степень выраженности, при этом разрешающими агентами могут быть не только сами антибиотики, но и продукты метаболизма.

Результатом является токсичность аллергического типа или непосредственно токсический эффект в отношении одного из жизненно важных органов - печени, почек, костного мозга. Описано возникновение дерматита у людей, потреблявших молоко, загрязненное пенициллином, и исчезновение его после обработки молока пенициллиназой.

Организм человека может быть сенсибилизирован различными путями, в том числе в результате потребления пищи, содержащей остаточные количества антибактериальных препаратов, применяемых в практике животноводства.

Очевидно, что последующее терапевтическое назначение антибиотиков сенсибилизированным лицам противопоказано из-за развития нежелательных

аллергических реакций. Помимо указанных, откорм животных с помощью антибиотиков имеет и другие отрицательные стороны.

Согласно данным ряда авторов, возникают трудности при исследовании проб мяса на патогенные микробы, в связи с чем бывает нелегко диагностировать сибирскую язву и сальмонеллез; нарушаются технологические процессы при производстве определенных видов продуктов из мяса и в ряде случаев изменяются органолептические свойства пищи; появляется склонность к ожирению при откорме птицы, что, безусловно изменяет биологическую ценность такой продукции.

В связи с потенциальной опасностью для здоровья человека выявленных сторон побочного действия антибиотиков отношение к их широкому применению в качестве добавок в корм животных стало в последние годы более осторожным.

Быстрое развитие науки и изменения в характере потребления, а также обеспокоенность потребителей остаточными количествами лекарственных средств указывают на необходимость периодического обследования этого большого класса веществ. Соединения, которые удовлетворяют минимальным требованиям современных стандартов, оцениваются со всех точек зрения, и в первую очередь со стороны их использования и воздействия на потребителя.

Объектами контроля при проведении мониторинга являются образцы, получаемые от живых животных непосредственно в хозяйствах, а также вся продукция животного происхождения, корма и кормовые добавки, отбираемые на бойнях, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, комбикормовых заводах.

Результаты проведенного мониторинга сырья и продуктов животноводства свидетельствуют о том, что на потребительский рынок постоянно поступает продукция отечественного производства с повышенным содержанием антибиотиков. Остаточные количества антибиотиков содержатся в мясе крупного рогатого скота и свиней, в молоке и молочных продуктах, в мясе и субпродуктах птицы, в рыбе. Чаще всего в исследованных образцах обнаруживается тетрациклин, реже - левомицетин, стрептомицин, пенициллин и гризин. Однако, нужно отметить, что в различных лабораториях различаются объемы выработки, спектр определяемых веществ, критерии выбора антибиотиков для исследований, а также методы пробоподготовки исследуемых продуктов, которые на данный

момент не стандартизированы.

Тот факт, что остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в

пищевых продуктах, может свидетельствовать о том, что нарушаются существующие инструкции по их применению или сроки выдержки животных перед убоем после последней дачи антибиотика недостаточны.

В отобранных образцах определяли остаточные количества только тех

антибиотиков, для которых нормативной документацией установлены предельно допустимые концентрации. Другие антибиотики и их комбинации, которые появляются на рынке ветеринарных препаратов, не выявлялись по той причине, что нет разработанных и утвержденных методик их определения.

В настоящее время целесообразно расширять круг выявляемых антибиотиков и разрабатывать универсальные методы их обнаружения в продуктах убоя, базирующиеся на подборе наиболее чувствительных тест-культур к наибольшему спектру антибиотиков.

Проблема поступления лекарственных веществ в продукцию животноводства, решаемая в течение последних десятилетий, не утратила своей новизны. Специалистам необходимо выработать единую концепцию и

подходить к применению антибиотиков по принципу строжайшего контроля их использования во всех отраслях сельского хозяйства и перерабатывающей

промышленности.

Мы полностью согласны с этими выводами, однако с целью стандартизации и упрощения условий исследования, которые можно было бы воспроизвести в любой лаборатории, в собственных исследованиях для культивирования всех тест-культур мы использовали в качестве питательнойсреды перевар Хоттингера с содержанием 120 -140 мг% аминного азота с добавлением 1% глюкозы, рН среды 7,2 - 7,4. Она проста в приготовлении и наней получаются четкие зоны задержки роста штаммов микроорганизмов вокруг дисков, пропитанных антибиотиками.

Плотность инокулюма - это число засеваемых бактерий, отнесенное к объему, в котором они растут. Величина инокулюма общее число засеянных бактерий. В литературе [55] сообщается, что даже при очень низких концентрациях антибиотиков, например 0,01 мкг/мл, отношение числа молекул антибиотика к числу бактериальных клеток остается очень большим. Это важно учитывать, так как, если плотность бактерий высока, число свободных молекул антибиотика, которые могут проникнуть в клетку, очень сильно снижается. В результате проведенных исследований мы считаем, что плотность инокулюма должна составляет 1 млрд. бактериальных клеток в 1мл культуральной жидкости, величина инокулюма 1 мл на одну чашку Петри, температура культивирования — 35-37С в течение 18 часов.

Нагревание используют для выпаривания воды, когда она в больших количествах содержится в образцах (молоко). Высокое содержание воды затрудняет проведение экстракции. Поэтому хорошо бы образец предварительно лиофильно высушивать, а не нагревать свыше 60

С.

Использование нагревания системы свыше 60

С сопряжено с разрушением исследуемых препаратов, так как антибиотики растворены в водной среде и при высокой температуре частично инактивируются. Кроме того, при осаждении белков под действием высокой температуры на осадке возможна сорбция некоторого количества лекарственного препарата. Это уменьшает их извлечение.

Метанол по силе депротеинизирующего действия уступает ацетону. Кроме того, для работы с метанолом требуется специальный допуск, имеются сложности с его приобретением и хранением.

Использование ацетона в качестве экстрагента заметно улучшает степень извлечения препаратов по сравнению с буферными системами, и несколько по сравнению с метанолом. Исходя из экспериментально полученных данных, для выделения антибиотиков нами был выбран метод экстракции ацетоном. Для молока обязательно предварительное центрифугирование с целью обезжиривания. Сначала удаляли слой жира и переносили аликвоту обезжиренного молока в чистую пробирку. Перед центрифугированием пробы охлаждали до 8

С.

Необходимо отметить некоторые особенности и специфику в подготовке гомогената. В отличие от авторов (Л.Т. Даниелова, 1972), которые предлагают растирать исследуемый материал в фарфоровой ступке в присутствии кварцевого песка или битого стекла, мы использовали перемешивание образца в магнитной мешалке до желеподобной массы после мелкого предварительного измельчения.

Лабораториям для практической работы на сегодняшний день требуются легкодоступные экспресс-методы с высокой чувствительностью и удовлетворительными метрологическими характеристиками. Широкое применение находят иммунохимические методы анализа. Среди них твердофазный иммуноферментный анализ, использующийся для лекарственного мониторинга, антибиотикотерапии, контроля продуктов питания. Однако вопрос выбора иммунореагентов для выявления различных по химическому составу антибиотиков недостаточно изучен. Иммунохимические методы имеют широко распространение при проведении лекарственного мониторинга в целях контроля уровня содержания лекарства в организме. Проводят их, чтобы убедиться, что выбранный режим дозировки для каждого конкретного пациента приводит к возникновению терапевтически эффективных концентраций в организме больного, которые в то же время не должны оказывать токсического действия.

Осуществление такого мониторинга необходимо в отношении антибиотиков, имеющих серьезные побочные эффекты, возникающие при концентрациях, лишь незначительно превышающих их терапевтический диапазон. Это особенно актуально, если пациент страдает нарушением функций печени и почек, что может привести к непредсказуемым изменениям метаболизма антибиотика и его экскреции из организма. К таким антибиотикам относятся аминогликозиды (в частности, гентамицин) и хлорамфеникол (особенно при лечении им грудных детей).

В основе иммуноанализа лежит обратимое нековалентное связывание антибиотика со специфическими антителами. Эта реакция подчиняется закону действия масс: Ag + Ab = Ag:Ab, где Ag — антиген (антибиотик), АЬ — специфические антитела, Ag : Ab — комплекс антиген-антитело.

Реакция обычно протекает до установления в системе равновесия, когда количество антигена, присутствующего в свободной и связанной фракциях, будет оставаться постоянным. Иммунохимический анализ существенно отличается от микробиологических методов определения антибиотиков. При проведении микробиологического анализа антибиотик связывается с белковым рецептором на поверхности или внутри используемой бактериальной клетки, что приводит к смерти микроорганизма или прекращению его размножения. Таким образом, в данном случае анализ зависит от того, какое действие оказывает определяемый антибиотик на бактериальную клетку. Основное отличие иммуноанализа заключается в том, что последний зависит от структуры определяемого антибиотика, точнее от структуры той части его молекулы, которая ответственна за связывание с антителами (называемой антигенной детерминантой или эпитопом). При этом даже незначительное изменение в структуре определяемого вещества (например, наличие или отсутствие гидроксигруппы) может существенно влиять на связывание с антителами. Следовательно, на результаты микробиологического анализа могут оказывать влияние другие антибиотики, которые присутствуют одновременно с определяемым, антимикробные вещества, присутствующие в образце, а также биологически активные метаболиты. Напротив, при проведении иммуноанализа происходит определение содержания антибиотика и его метаболитов со сходной структурой антигенной детерминанты, независимо от того, являются они биологически активными или нет. Наличие в образце других антибиотиков и антимикробных веществ, как правило, не влияет на результаты иммуноанализа. Учитывая также более высокие, по сравнению с микробиологическими методами, чувствительность, специфичность и точность иммуноанализа, предпочтение отдается последнему в тех случаях, когда необходима высокая точность количественного определения, что происходит чаще всего в медицине.

Метод иммуноферментного анализа основан на уменьшении ферментативной активности, происходящей при связывании антибиотика, меченного ферментом (пероксидазой хрена), со специфическими антителами. При увеличении концентрации определяемого антибиотика концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной реакции, иммобилизованный на полистироловой поверхности.

Одним из основных реагентов для иммунохимического анализа, в значительной степени определяющим его характеристики (в частности, чувствительность и специфичность), являются антитела. Первая работа, в которой сообщалось о получении специфических антител против ХАФ (хлорамфеникола), появилась в 1966 году. Данный метод основан на конкурентном связывании со специфическими поликлональными антителами ХАФ, иммобилизованного на твердой фазе, и свободного ХАФ, содержащегося в стандартном растворе (или анализируемом образце). Для детекции используется коммерческий ферментный конъюгат с антивидовыми антителам.

После добавления субстрата ферментативная активность измеряется__ спектрофотометрически. Она обратно пропорциональна концентрации ХАФ в образце. Предел обнаружения ХАФ составляет 1 нг/мл, линейный диапазон определяемых концентраций антибиотика — 1-100 нг/мл. Анализ обладает высокой специфичностью по отношению к ХАФ (из 31 антибиотика перекрестная реактивность наблюдается лишь в случае сукцината ХАФ и тиамфеникола). Время анализа составляет приблизительно 12 часов. В настоящее время контроль продуктов питания с целью определения в них остаточных количеств антибиотика осуществляется при сочетании простых, экспрессных и недорогих скрининговых методов для рутинного анализа и более длительных и дорогих количественных методов. Полученные результаты. Нами методом ИФА проводились исследования животноводческой продукции на содержание левомицетина и тетрациклина с использованием тест-систем RIDASCREEN-Левомицетин и RIDESCREEN Тетрациклин (ООО «Стайлаб» R-Biopharm).